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牛病毒性腹泻黏膜病（BVD）是由牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）感染引起的疾病，它被国际兽疫局（OIE）定为B类传染病，我国在进出口检疫中把它定位为二类传染病。其临床症状主要表现为腹泻，消化道黏膜脱落、糜烂。会导致母畜流产、死胎和畸胎等。尤其是会产生持续性感染和免疫耐受，在临床检测上经常出现漏检和检不出的情况，这给该病的预防、诊断、治疗带来障碍。针对上述问题，本论文以研究实用的诊断方法为出发点，旨在为生产实践过程中出现的不同情况提供针对性的检测方法，具体成果如下：1建立SYER Green荧光定量RT-PCR方法本实验针对BVDV5’端非翻译区的保守序列设计了一对特异性的引物，进行普通PCR扩增反应，目的基因片段长度是181bp。实验建立并优化了SYERGreen荧光定量RT-PCR方法，熔解曲线分析结果显示在86.5±0.5℃为单一峰，无引物二聚体和非特异性扩增现象。通过荧光定量RT-PCR方法建立了标准曲线，扩增效率为95.36%，相关系数为0.996，在102～108范围内具有良好的线性关系。对47份血清的检测结果显示荧光RT-PCR方法准确、特异性强，在4小时内就可以得到检测结果。SYER Green荧光定量RT-PCR方法与TaqMan荧光定量RT-PCR方法相比，除了具有特异性强、灵敏度高、反应迅速等共同优点外，它还要比TaqMan方法更经济、操作更简单等优点。因此该方法可以广泛应用于各级出入境检验检疫等各种情况下的BVDV检测，尤其是对持续性感染和免疫耐受的检出具有重要作用。2建立BVDV间接ELISA方法BVDV在生物学上具有两种细胞型—致细胞病变（CP）型和非致细胞病变（NCP）型，为了鉴别CP型与NCP型，本实验建立了间接ELISA方法。本实验用牛肾细胞（MDBK）分别制备了CP型BVDV OregonC24株和NCP型的BVDVYak株病毒,用PEG2000分别将其浓缩，得到两种高纯度的抗原。用上述2种病毒分别免疫新西兰长耳兔制得相应的高免血清。建立并优化的间接ELISA反应条件是：HRP-羊抗兔IgG工作最佳浓度为1：2000，抗原的最佳包被浓度是1：1000，待检血清稀释浓度为1：100，封闭液最佳选择用5%牛血清白蛋白（BSA），最佳封闭时间1小时，最佳显色时间为15min。特异性和重复性检测结果证明了本方法具有结果准确、操作简便等优点。通过对已知CP型、NCP型的阳性血清进行测定，两种血清的OD450不同，CP型要比NCP型OD450高0.31。根据CP型与NCP型抗体效价的不同，推测可根据抗体效价不同识别BVDV的CP型和NCP型，以及疫苗株和野毒株。3证实了新城疫病毒强化试验（END）可以检测牛病毒性腹泻病毒猪瘟病毒接种到猪肾细胞上，不产生细胞病变，再将新城疫病毒（NDV）接种该细胞上，则可以产生细胞病变,这种新城疫病毒强化猪瘟病毒使之发生细胞病变的现象称为新城疫病毒强化（Exaltation of NDV,END）试验，所以新城疫病毒强化实验是猪瘟病毒的一种检测方法。本实验在培养的牛肾细胞（MDBK）上接种了牛病毒性腹泻病毒（BVDV）Yak株（NCP型），在37℃、CO2下含量为5%的恒温培养箱中培养3天，通过倒置显微镜没有观察到细胞病变，再将10倍蚀斑的新城疫病毒（NDV）接种到该细胞上，在相同条件下培养3天，观察到该细胞产生了细胞病变，这一结果说明了NDV可以强化NCP型BVDVYak株。本实验首次证实了NDV对NCP型BVDV具有干扰作用， END实验可以作为NCP型BVDV的一种检测方法。