背景和目的:肺癌是一个全球性的健康问题,每年约有210万人被诊断为肺癌,180万人死于肺癌。近年来,肺癌发病率在全球水平上持续上升。尽管一些西方国家的肺癌发病率在下降,但其死亡率仍然较高,严重威胁生命。由于早期无特异性的症状,大多数病例被确诊时已经为Ⅳ期,即无法通过手术、化疗等手段治愈的转移性疾病,预后较差。研究表明,相关基因的缺失,突变和扩增可以显著促进肺癌的发生和发展。因此,探索影响肺癌调控的关键分子靶标将进一步提高对肺癌发病机理的认识。同时,通过探索相关分子,可以发现强大而有效的诊断标记物用于临床预防治疗。在人类的基因组中,RNA从DNA转录而来,成为DNA和蛋白质之间的桥梁。RNA可分为编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）,mRNA仅占所有基因序列的不到2%,因此ncRNA中的突变会导致大多数癌症表型。近年来,高通量测序技术的进步揭示了许多ncRNA与癌症的关系,大量研究表明ncRNA在各种类型的癌症中失调。长链非编码RNA（lncRNA）是转录长度超过200 nt的一种ncRNA。近年来,lncRNA被认为是人类癌症的主要决定因素,尽管其缺乏蛋白质编码序列,但它们具有特殊的结构、结合位点以及生物学功能,可以用作重要的调节RNA,与mRNA、miRNA、蛋白质间相互作用,形成功能网络,进而参与到一些疾病的发生发展。许多lncRNA也在肺肿瘤的分化组织和特定类型中独特表达,这些有望成为肺癌早期诊断的生物标志物。LINC00115是一种新兴的LncRNA,目前发现其在卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌中高表达并影响了它们的发生发展过程,但未见其与肺癌的相关研究,因此本研究首次综合分析了 LINC00115在肺癌中表达及其生物学作用,并初步研究了其对肺癌调节作用的分子机制。本研究包括三部分内容:第一部分探究LINC00115在肺癌组织的异常表达及其与患者的临床病理和预后的相关性;第二部分探究LINC00115对肺癌细胞增殖、侵袭与迁移的影响;第三部分探究LINC00115通过靶向miR-615-3p/SMARCE1调控肺癌增殖、侵袭和迁移的分子机制。第一部分非编码LINC00115在肺癌组织中的表达及其临床意义目的:探讨非编码LINC00115在肺癌组织中的异常表达及与患者的临床特征和预后的相关性。方法:1.收集肺癌组织,通过非编码RNA测序方法分析其中的LncRNA的表达变化,利用EdgeR软件分析基因在各样本中的差异表达情况,筛选出目标LncRNA。2.对TCGA数据库中肺癌相关转录组数据进行分析,进一步考察LncRNA LINC00115在肺癌组织中的表达。3.采用qRT-PCR检测LINC00115在癌组织、癌旁组织和转移组织中的表达情况及其与肺癌患者临床特征的相关性。4.通过Kaplan-Meier单因素分析和COX多因素分析筛选出影响肺癌患者无进展生存期的独立危险因素。结果:1.在肺癌组织中,我们一共筛选有2120个lncRNA转录水平发生明显的改变,其中1070个lncRNA转录表达水平显著增加（P＜0.05）,1050个lncRNA转录表达水平显著降低（P＜0.05）。通过进一步对上调和下调的lncRNA进行生物信息分析与功能预测,筛选发现非编码LINC00115在肺癌组织中显著上调（P＜0.001）。2.分析TCGA数据库中肺癌的测序数据,发现与癌旁正常组织相比,LINC00115在肺癌组织中高表达,并与患者的T stage和TNM stage具有相关性（P＜0.05）。3.qRT-PCR结果显示,与癌旁组织相比,LINC00115在肺癌组织中的表达量显著升高（P＜0.01）。此外,与癌组织相比,肺癌转移病灶组织中的LINC00115的表达量显著增加（P＜0.05）。根据LINC00115的表达高低区分,其中表达水平大于等于3.64的为高表达组（≥3.64）,表达水平小于3.64（＜3.64）的为低表达组,分析与肺癌患者的临床病理特征的相关性。结果显示LINC00115的表达程度与患者分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移具有显著的相关性（P＜0.05）。4.多因素分析筛选出TNM分期、LINC00115表达水平是影响肺癌预后的独立的预后因子,TNM分期为I～Ⅱ、LINC00115低表达的患者无进展生存期较长。结论:非编码LINC00115在肺癌组织中的异常表达,与患者的临床特征和预后具有显著的相关性,在肺癌的发生发展及预后过程中具有重要价值。第二部分LINC00115对肺癌细胞增殖、侵袭与迁移的影响目的:探讨LINC00115对肺癌细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法:1.应用qRT-PCR测定常见肺癌细胞系（A549、PC-9、HCC-78、SPC-A-1）及正常支气管上皮细胞16-HBE中LINC00115的表达水平。2.建立慢病毒转染LINC00115干扰序列1（shRNA-1）、LINC00115干扰序列2（shRNA-2）,通过转染A549和PC-9细胞建立LINC00115稳定敲低的肺癌细胞系。3.MTT细胞活性检测试剂盒检测LINC00115稳定敲低的肺癌细胞的增殖能力,通过平板克隆形成实验进行评估LINC00115稳定敲低对肺癌细胞的长期增殖能力的影响。4.采用细胞划痕实验,评估体外检测敲低LINC00115对肺癌A549和PC-9细胞运动特征的影响。5.通过Transwell实验进行检测敲低LINC00115对肺癌A549和PC-9细胞侵袭与迁移的影响。6.通过Western blot检测敲低LINC00115对肺癌细胞的EMT过程中主要相关基因的表达情况。结果:1.与正常支气管上皮细胞16-HBE相比,LINC00115在肺癌细胞中的表达水平显著增加,其中在A549和PC-9细胞中的表达水平增加最多。2.在A549和PC-9细胞中,干扰序列2（shRNA-2）比干扰序列1（shRNA-1）具有更高的干扰效率,并成功构建敲低LINC00115的干扰shRNA的慢病毒载体和稳定的细胞系。3.MTT细胞活性检测结果显示在肺癌细胞中,敲低LINC00115的表达能显著抑制细胞的增殖能力。在A549和PC-9细胞中,与空白对照组相比,慢病毒干扰空白对照组对细胞增殖活性没有显著的影响。与慢病毒干扰空白对照组相比,转染含有LINC00115干扰序列1（shRNA-1）和干扰序列2（shRNA-2）的慢病毒48小时后,能显著抑制A549细胞的增殖能力,随着培养的时间延长到72和96h时,抑制效果越来越明显。与慢病毒干扰空白对照组相比,转染含有LINC00115干扰序列1（shRNA-1）和干扰序列2（shRNA-2）的慢病毒48后,能显著抑制PC-9细胞的增殖能力,随着培养的时间延长72h时,干扰序列2的抑制效果比干扰序列1更为显著。平板克隆形成实验结果显示,与慢病毒干扰空白对照组相比,敲低LINC00115的表达能显著抑制A549细胞和PC-9细胞的平板克隆形成能力。4.细胞划痕实验结果显示,与空白对照组相比,慢病毒干扰空白对照组对细胞迁移能力没有显著的影响。而与慢病毒干扰空白对照组相比,转染含有LINC00115干扰序列1（shRNA-1）和干扰序列2（shRNA-2）的慢病毒后,A549细胞和PC-9细胞的迁移能力显著受到抑制。5.Transwell实验显示,无论在A549细胞还是PC-9细胞中,与空白对照组相比,慢病毒干扰空白对照组对细胞迁移能力没有显著的影响。而与慢病毒干扰空白对照组相比,干扰LINC00115（shRNA-1）和（shRNA-2）后,都能显著抑制A549细胞和PC-9细胞从上室迁移到下层的能力,同时也能显著抑制A549细胞和PC-9细胞穿过Matrigel从上室侵袭到下层的能力。6.Western blot结果显示,无论在A549细胞还是PC-9细胞中,与空白对照组相比,慢病毒干扰空白对照组对细胞内EMT相关蛋白的表达没有显著的影响。但与慢病毒干扰空白对照组相比,敲低LINC00115的shRNA-1和shRNA-2都能显著促进A549细胞和PC-9细胞中E-黏连蛋白的表达,抑制N-黏连蛋白、波形蛋白和纤连蛋白的表达,而对转录因子Snail-1和Twist的表达没有显著的影响。结论:敲低LINC00115能显著抑制肺癌细胞增殖、克隆、侵袭和迁移的能力。第三部分 LINC00115 通过靶向 miR-615-3p/SMARCE1调控肺癌细胞增殖和侵袭目的:探究LINC00115通过靶向miR-615-3p/SMARCEl调控肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制。方法:1.LINC00115定位,先通过免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察初步确定LINC00115在A549和PC-9细胞内的定位,然后分离A549和PC-9细胞的细胞核和细胞质,提取总RNA,通过qRT-PCR检测LINC00115在其中的含量,验证LINC00115在细胞中的定位。2.筛选相关miRNA,先通过生物信息学分析和检测分析LINC00115序列中可能结合的miRNA,再通过qRT-PCR检测确定在敲低LINC00115的A549和PC-9细胞中表达异常的miRNA以确定目标miRNA。3.检测目标miRNA与LINC00115的结合,先通过RNA结合蛋白免疫沉淀试验初步确定二者结合,再通过双荧光素酶报告基因检测验证目标miRNA与LINC00115之间的结合活性。4.通过qRT-PCR检测敲低LINC00115后细胞内miR-615-3p的表达水平以确定miRNA与LINC00115之间的调控关系。5.提取 A549、PC-9、HCC-78、SPC-A-1、16-HBE 及肺癌组织中的总 RNA,采用试剂盒、qRT-PCR测定其中miR-615-3p的表达水平。6.将合成miR-615-3p mimics分别转染A549、PC-9细胞48小时。转染结束后,采用平板克隆形成实验和Transwell实验评估过表达miR-615-3p对A549、PC-9细胞增殖和侵袭的能力的影响。7.采用生物信息学软件和开源数据库预测miR-615-3p下游的靶基因。通过提取细胞总RNA,检测目标下游基因mRNA的表达水平。采用荧光素酶活性检测目标下游基因与miR-615-3p的活性结合。8.采用 Western blot 实验检测 LINC00115 通过 miR-615-3p 调控 SMARCE1 的表达情况。MTT 和 Transwell 实验证明 LINC00115 是否通过 miR-615-3p/SMARCEl 信号轴调控肺癌细胞的增殖与侵袭能力。9.进行体内实验,将转染后的A549细胞接种到裸鼠皮下,5d后测量肿瘤大小,第35d时,处死裸鼠,剥离移植肿瘤并进行拍照,同时用电子天平对剥离的移植瘤组织进行称重。收集移植瘤组织后一部分进行甲醛固定,另一部分冻存在液氮中用于后续检测。经甲醛固定的移植瘤组织行切片、HE染色观察其中肿瘤细胞的形态特征,同时通过免疫组织化学检测细胞增殖相关蛋白Ki-67、E-cadherin和SMARCE1的表达。另一部分移植瘤,提取其总RNA,通过qRT-PCR检测移植瘤组织中的LINC00115和miRNA-615-3p的表达水平。结果:1.qRT-PCR和RNA-FISH实验证明LINC00115主要定位在细胞质中。2.生物信息学软件和开源数据库预测miR-615-3p可能是LINC00115下游调控靶基因,进一步qRT-PCR检测结果显示在敲低LINC00115的A549和PC-9细胞中,miR-615-3p表达水平最高,提示miR-615-3p为LINC00115的下游调控分子。3.RNA结合蛋白免疫共沉淀显示在anti-Ago2的富集物中能同时检查到miR-615-3p与LINC00115的高表达,提示二者可能结合并具有调控的关系。荧光素酶活性检测结果显示,与miRNA-NC和野生型（Wt）LINC00115组相比,野生型（Wt）LINC00115与miR-615-3p共转染进A549、293T细胞后荧光素酶报告基因的转录活性显著降低,LINC00115 能直接结合 miR-615-3p。4.qRT-PCR检测结果显示在A549和PC-9细胞中,与Control组或shRNA-Control组相比,敲低LINC00115（shRNA-2）能显著上调miR-615-3p的表达水平,即LINC00115能负调控miR-615-3p的表达。5.qRT-PCR检测结果显示与癌旁组织（Normal）组相比,在肺癌组织中miR-615-3p的表达水平显著降低。与正常支气管上皮细胞16-HBE相比,miR-615-3p在肺癌细胞中的表达水平显著降低,其中在A549和PC-9细胞中的表达水平最低。6.过表达 miR-615-3p（miR-615-3pmimics）能显著抑制肺癌（A549 和 PC-9）细胞的克隆形成数量,也能显著抑制肺癌细胞的从Transwell的上室侵袭到下室能力。7.通过2个在线生物信息学预测软件预测miR-615-3p调控的下游靶基因,结合二者的交集发现,其调控的下游靶基因有5个,进一步qRT-PCR检测发现在肺癌细胞系中SMARCE1可能是miR-615-3p的下游调控靶分子。通过荧光素酶报告证明miR-615-3p能结合SMARCE1的3’UTR区。Westernblot检测显示在A549细胞中过表达miR-615-3p能显著抑制SMARCE1的表达,而在PC-9细胞中抑制miR-615-3p能显著促进SMARCE1的表达。8.Western blot检测结果显示敲低LINC00115能显著抑制SMARCE1的表达,而添加miRNA-615-3p inhibitor后能显著阻断这种抑制作用。最后通过MTT和Transwell实验证明LINC00115通过miR-615-3p/SMARCE1信号轴调控肺癌细胞的增殖与侵袭能力。9.体内实验证明敲低LINC00115能显著抑制肺癌（A549）细胞在裸鼠皮下的生长能力,同时抑制移植荷瘤组织的重量。qRT-PCR检测显示与contro-shRNA组相比,在shRNA-2（敲低LINC00115）组移植瘤组织中LINC00115的表达量显著降低,而miRAN-615-3p的表达量显著升高。进一步通过免疫组织化学染色结果显示,与contro-shRNA组相比,在shRNA-2（敲低LINC00115）组移植瘤组织中Ki-67和SMARCE1表达水平显著降低,而E-cadherin表达水平显著升高。这提示LINC00115通过调控miRNA-615-3p/SMARCE1信号轴影响了肺癌细胞的增殖和侵袭能力。结论:LINC00115通过miRNA-615-3p/SMARCE1信号轴调控影响了肺癌细胞的增殖和侵袭能力。总结:本研究基于组织测序筛选到一个未在肺癌组织中报道的新lncRNA:LINC00115,通过TCGA数据、64例肺癌组织验证证明LINC00115高表达与肺癌患者临床病理具有显著的相关性。细胞功能实验证明敲低LINC00115能显著抑制肺癌细胞增殖、克隆形成、侵袭与迁移能力。敲低LINC00115还能显著抑制EMT相关基因的表达。分子机制研究显示LINC00115主要定位在细胞质,并作为竞争性内源RNA结合调控miR-615-3p的表达,过表达miR-615-3p能显著抑制肺癌细胞的克隆形成和侵袭能力。miR-615-3p能直接结合SMARCE1 mRNA 3’UTR区进而调控后者的表达,而敲低LINC00115能显著抑制SMARCE1的表达。体内实验证明敲低LINC00115能通过抑制Ki-67的表达,促进E-cadherin的表达显著抑制肺癌细胞在体内的增殖与侵袭能力,促进miR-615-3p的表达,抑制SMARCE1的表达。本研究结果揭示了 LINC00115在肺癌发生、发展中的分子机制,为肺癌的潜在早期诊断、靶向治疗提供了分子靶标和理论依据。