UPLC-MS/MS技术结合网络药理学研究刺老苞治疗骨质疏松症的有效成分及其作用机制

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[目的]在前期的药理研究基础上,对刺老苞进行全成分分析,并从中筛选出重要候选成分,对其体外促成骨细胞增殖作用及机制进行初探。[方法]运用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术,准确获取刺老苞全部化学成分信息;将分析得到的化学成分利用TCMSP、STITCH数据库获得化合物预测靶点,利用UniProt数据库将所有靶点名称校正为官方名称;通过DisGeNET、TTD、GeneCards、OMIM、Drugbank数据库获得骨质疏松症相关靶点;根据上述靶点信息,获得药物和疾病交集靶点并构建“刺老苞-化合物-靶点-疾病”之间的相互关系网络,然后根据作用靶点数目筛选出候选化合物;获取原代成骨细胞,通过MTT法分别检测刺老苞粗提物以及候选化合物对成骨细胞增殖的影响,并确定候选化合物药物作用浓度;运用流式细胞术检测候选化合物对成骨细胞细胞周期的影响作用;利用Real Time PCR和Western blot法检测候选化合物对成骨细胞增殖基因转录和翻译水平的影响。[结果]1.运用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术总共分析得到刺老苞次生代谢物309种,经过活性筛选得到16个活性化合物。2.获取筛选活性化合物的作用靶点以及骨质疏松症的靶点,取交集靶点,其中熊果酸作用的疾病靶点数目最多,为26个。选取熊果酸作为候选单体化合物用于后续细胞实验。3.刺老苞粗提物和熊果酸在一定浓度范围内能促进成骨细胞的增殖,熊果酸的最适浓度为5 μM。选取5 μM、2.5 μM和1.25 μM分别作为高剂量、中剂量和低剂量。经过流式细胞仪检测表明,成骨细胞的细胞周期GO/G1期,与对照组相比较,各剂量组都有不同程度的降低,其中中剂量组、高剂量组降低最明显,均有显著性差异(P<0.01);成骨细胞的细胞周期G2/M期,与对照组相比较,各剂量组均有所降低,其中中剂量组、高剂量组存在显著性差异(P<0.05);成骨细胞的细胞周期S期以及G2/M+S期,与对照组相比,各剂量组均有所升高,存在显著性差异(P<0.01)。4.熊果酸干预成骨细胞48 h后,与对照组相比,成骨细胞中VEGFA和BMP-2的蛋白表达水平除了低剂量组未见明显升高外,中、高剂量组均显著升高(P<0.05或P<0.01),而成骨细胞中TGF-β1和IGF-1的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);成骨细胞中VEGFA、TGF-β1和IGF-1的mRNA表达水平除了中剂量不具有显著性差异外,低剂量和高剂量均显著降低(P<0.05或P<0.01),而成骨细胞中BMP-2的mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)。[结论]1、刺老苞粗提物能促进成骨细胞增殖,而熊果酸是发挥促增殖作用的重要活性成分;2、熊果酸浓度为1.25 μM、2.5 μM和5 μM时均能显著促进成骨细胞增殖,缩短细胞周期中G0/G1期、G2/M期,延长S期,且具有剂量依赖性;3、熊果酸体外干预后,成骨细胞中VEGFA、TGF-β1、IGF-1和BMP-2的mRNA表达水平降低,但蛋白表达水平升高,而从发挥促成骨细胞增殖作用。
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