CircRNA_0007843在前列腺癌细胞增殖和转移中的作用及初步机制研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong529
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前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是全世界范围内男性最常见的恶性肿瘤之一。目前,PCa的分子发病机制在很大程度上仍未阐明,寻找新的有效检测标志物和治疗靶点将有助于提高PCa的临床诊断和治疗水平。环状RNA(Circular RNA,circ RNAs)是一种广泛存在于人体各组织细胞中的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs),ncRNAs的表达失调与人类机体内稳态调节紊乱而导致的异常生命活动紧密相关。因具有表达相对保守,结构稳定不易降解等生物学特征,circ RNAs在基因表达调控和肿瘤研究领域中的作用越来越受到关注。对circ RNAs在PCa产生及进展过程的一般规律进行深入的探究,在更详细深刻的阐明PCa的发病机理,同时找寻更加高效的治疗靶标方面具有重要的价值。本研究以circ_0007843为研究对象,探讨circ_0007843在PCa细胞增殖和转移中的作用和机制,以及作为PCa诊断和治疗靶点的潜在价值。目的:研究circ_0007843在PCa细胞增殖和转移中的作用,探讨其相关分子机制。方法:1.通过文献检索,生物信息学分析和qRT-PCR验证,选定在PCa细胞中异常表达的环状RNA circ_0007843为研究目标;2.设计合成circ_0007843小干扰RNA(si-circ_0007843),分别转染PCa细胞株PC3和DU145,运用细胞克隆形成,CCK8,划痕愈合,transewell实验和流式细胞法检测circ_0007843沉默对PCa细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期进程的影响。3.使用生物信息学软件分析预测circ_0007843下游靶标miRNAs,使用qRT-PCR对circ_0007843沉默后表达异常升高的miRNAs进行筛选,初步确定miRNA-3064-5p为circ_0007843的潜在下游靶标miRNA;4.构建含有circ_0007843和miRNA-3064-5p结合位点(WT)/突变结合位点(Mut)的荧光素酶报告基因质粒,运用双荧光素酶报告法针对miRNA-3064-5p、circ_0007843靶向结合关系进行验证;5.运用qRT-PCR得到miRNA-3064-5p在PCa细胞与前列腺正常上皮细胞中的相对表达,合成miRNA-3064-5p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),分别转染PC3和DU145细胞,通过细胞克隆形成实验,CCK8实验,划痕愈合实验,transewell实验和流式细胞法检测miRNA-3064-5p在PCa细胞增殖、迁移、侵袭还有细胞周期进程中的作用;6.利用在线生信分析推测miRNA-3064-5p下游作用的靶基因,筛选出与细胞周期调控有关的真核翻译起始因子5(Eukaryotic translation initiation factor 5 EIF5)作为研究对象,对miRNA-3064-5p、EIF5靶向结合关系可通过western blot、双荧光素酶报告实验进行进一步验证;7.共转染si-circ_0007843和miRNA-3064-5p inhibitor,通过CCK8、划痕愈合、transwell实验观察共转染对PCa细胞增殖、转移的影响,运用western blot得到EIF5蛋白的表达水平。结果:1.qRT-PCR检测结果显示,circ_0007843在PCa细胞PC3、DU145、22RV1和LNCa P中的表达远远高于circ_0007843在正常人前列腺上皮细胞RWPE-1的表达(P<0.05);2.细胞克隆形成,CCK8,加上划痕愈合,transwell实验和流式细胞法检测结果显示,在转染si-circ_0007843后、PCa细胞增殖、迁移、侵袭能力和细胞周期进程相较于转染si-circ nc的组均表现出抑制(P<0.05);3.生物信息学软件分析结果显示,miRNA-3064-5p与circ_0007843之间存在潜在的靶向结合位点,qRT-PCR检测发现沉默circ_0007843可显著增强miRNA-3064-5p的表达;4.双荧光素酶报告法检测结果显示,与对照组相比,共转染miRNA-3064-5p和circ_0007843-WT组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05);5.qRT-PCR检测结果说明,与正常人的RWPE-1相比,PCa细胞:PC3、DU145、22RV1和LNCa P中miRNA-3064-5p的表达显著下调(P<0.05),转染miRNA-3064-5p mimic抑制了PC3和DU145细胞的增殖、迁移、侵袭及细胞周期进程,而转染miRNA-3064-5p inhibitor后结果则相反;6.生物信息学分析结果显示EIF5基因是miRNA-3064-5p的一个潜在下游靶基因,双荧光素酶报告法可以说明EIF5、miRNA-3064-5p有可以靶向结合的位点,转染miRNA-3064-5p mimic可明显抑制PC3和DU145细胞中EIF5蛋白的表达;7.CCK8实验、划痕愈合实验和transwell实验结果显示,共转染si-circ_0007843和miRNA-3064-5p inhibitor可显著逆转单独转染si-circ_0007843对PC3和DU145细胞的增殖、迁移加侵袭能力的抑制作用;western blot曝光结果可以看到,单独转染si-circ_0007843时PC3和DU145细胞中EIF5蛋白表达明显下调,共转染miRNA-3064-5p inhibitor可在一定程度上增强EIF5蛋白的表达。结论:1.Circ_0007843在PCa细胞中高表达,沉默circ_0007843可显著抑制PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期进程;Circ_0007843能够靶向调节miRNA-3064-5p,沉默circ_0007843可使得miRNA-3064-5p表达上调;2.miRNA-3064-5p在PCa细胞中较RWPE-1低表达,miRNA-3064-5p有抑制PCa细胞的增殖、迁移、侵袭,细胞周期进程的作用;4.miRNA-3064-5p能够通过靶向结合调节EIF5表达;5.Circ_0007843通过miRNA-3064-5p调控PCa细胞增殖、迁移、侵袭过程并调控EIF5的表达。
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