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随着石化资源的不断消耗，气候的不断恶化，人们逐渐从石化经济向生物经济转变，利用可再生资源生产高附加值生物制品是实现社会可持续发展和循环经济的必然选择。3-羟基丙酸(3-HP)两次被美国能源部评选为优先开发的化学品之一，以其为前体可合成多种具有商业价值的化合物，被广泛用于材料、化工、医学等领域。
目前，3-HP以生物法中基因工程菌合成为主，具有合成产量高、途径易改善等优点。
本文使用葡萄糖为唯一碳源，选取遗传背景清晰、廉价易得的大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株构建丙二酸单酰辅酶A途径，通过对代谢通路的改造达到高效合成3-HP的目的。主要内容如下:
(1)以实验室保存的质粒为模板，设计3对含同源片段的引物，通过PCR扩增出目的片段，利用重组连接酶构建含丙二酸单酰辅酶A还原酶mcr基因的重组质粒pA2c-mcr，对其进行菌液PCR、酶切及测序验证，并对目的蛋白表达进行验证。
(2)为提高丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)的活性，利用定点突变技术设计两对突变引物，构建含多个突变位点(N940V/K1106W/S114R)的重组质粒pA2c-mcr*，菌液PCR及测序验证表明位点已成动突变，并且突变后MCR酶活性有显著提高。再将突变质粒pA2c-mcr*与含乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的重组质粒pBbE7a-accDABC共同转入E.coli BL21(DE3)得到重组菌株ZYL5，经初步发酵验证，该菌株在诱导条件下可合成0.29g/L的3-HP，与未突变的重组菌株ZYL4相比，产量提高1.8倍左右。
(3)为了将具有响应丙二酸单酰辅酶A浓度特性的FapR转录因子引入该途径，对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的FapR转录因子进行生物信息学分析，分析得出该转录因子氨基酸碱基数为188，相对分了量为21400.34，脂肪酸系数为102.66，蛋白等电点为5.53，属于亲水性、稳定蛋白。在结构和功能方面，主要在细胞核内发挥作用，为非分泌蛋白，不能进行跨膜，且体内存在两个不同功能的保守结构域HTH与硫脂酶家族，可有效与DNA序列和中间代谢物相结合。对蛋白质二级和三级结构验证发现，该蛋白以α螺旋为主，占整个结构的48.94％，而β转角结构较少，仪占7.45％。最后经同源序列比对及系统发育树的构建，得出无论在同源比例或亲缘关系上均与同菌属的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)具有更高的相似性，进化程度与亲缘关系相对较近。
(4)为降低代谢通路中产生的毒害作用，将含FapR转录因子的重组质粒pBFR1k-locI-FapR引入该途径中构建代谢物生物传感器。重组质粒经菌液PCR、酶切及测序验证后与pBbE7a-occD.4BC、pA2c-mcr*共同转入E.coli BL21(DE3)得到重组菌株ZYL8，经发酵培养验证，该动态调控3-HP合成的重组菌株ZYL8可合成0.43g/L的3-HP，与不含生物传感器菌株相比，产量提高1.6倍左右，且较初始菌株ZYL3提高约14倍。
目前，3-HP以生物法中基因工程菌合成为主，具有合成产量高、途径易改善等优点。
本文使用葡萄糖为唯一碳源，选取遗传背景清晰、廉价易得的大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株构建丙二酸单酰辅酶A途径，通过对代谢通路的改造达到高效合成3-HP的目的。主要内容如下:
(1)以实验室保存的质粒为模板，设计3对含同源片段的引物，通过PCR扩增出目的片段，利用重组连接酶构建含丙二酸单酰辅酶A还原酶mcr基因的重组质粒pA2c-mcr，对其进行菌液PCR、酶切及测序验证，并对目的蛋白表达进行验证。
(2)为提高丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)的活性，利用定点突变技术设计两对突变引物，构建含多个突变位点(N940V/K1106W/S114R)的重组质粒pA2c-mcr*，菌液PCR及测序验证表明位点已成动突变，并且突变后MCR酶活性有显著提高。再将突变质粒pA2c-mcr*与含乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的重组质粒pBbE7a-accDABC共同转入E.coli BL21(DE3)得到重组菌株ZYL5，经初步发酵验证，该菌株在诱导条件下可合成0.29g/L的3-HP，与未突变的重组菌株ZYL4相比，产量提高1.8倍左右。
(3)为了将具有响应丙二酸单酰辅酶A浓度特性的FapR转录因子引入该途径，对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的FapR转录因子进行生物信息学分析，分析得出该转录因子氨基酸碱基数为188，相对分了量为21400.34，脂肪酸系数为102.66，蛋白等电点为5.53，属于亲水性、稳定蛋白。在结构和功能方面，主要在细胞核内发挥作用，为非分泌蛋白，不能进行跨膜，且体内存在两个不同功能的保守结构域HTH与硫脂酶家族，可有效与DNA序列和中间代谢物相结合。对蛋白质二级和三级结构验证发现，该蛋白以α螺旋为主，占整个结构的48.94％，而β转角结构较少，仪占7.45％。最后经同源序列比对及系统发育树的构建，得出无论在同源比例或亲缘关系上均与同菌属的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)具有更高的相似性，进化程度与亲缘关系相对较近。
(4)为降低代谢通路中产生的毒害作用，将含FapR转录因子的重组质粒pBFR1k-locI-FapR引入该途径中构建代谢物生物传感器。重组质粒经菌液PCR、酶切及测序验证后与pBbE7a-occD.4BC、pA2c-mcr*共同转入E.coli BL21(DE3)得到重组菌株ZYL8，经发酵培养验证，该动态调控3-HP合成的重组菌株ZYL8可合成0.43g/L的3-HP，与不含生物传感器菌株相比，产量提高1.6倍左右，且较初始菌株ZYL3提高约14倍。