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目的:鼻咽癌在中国南方发病率极高,尤其是广东省,发病率较欧美等其他地区高25至30倍。鼻咽癌发生部位的隐匿性和早期临床表现的不明显性使得其早期诊断相对困难。而且,鼻咽癌具有高度侵袭性和转移性,一旦发生转移,患者预后较差。目前作为鼻咽癌主要治疗手段的放疗亦面临着肿瘤的辐射抗性和组织的严重损伤性两大难以解决的问题。所以,探讨鼻咽癌肿瘤发生、发展的相关机制至关重要。早日找到鼻咽癌特异性的标志物来指导临床进行早期诊断、治疗及预后评估,也必将带来重大的社会效益和经济效益。MicroRNAs(miRNAs)是一类约22个核苷酸的非编码单链RNA,它通过与靶mRNA3UTR区非特异性结合,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而调节在转录后水平特定基因的表达。近年来众多研究表明,miRNAs的差异表达与人类肿瘤密切相关,并参与到细胞发育的各个阶段,包括细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等。在此,我们旨在以鼻咽癌为研究对象,结合基础研究与临床应用,研究miR-494在鼻咽癌发生、发展中的生理功能,为鼻咽癌早期诊断、治疗以及研制新的基因靶向药物提供重要的实验线索和依据。 方法:我们用qRT-PCR检测miR-494在30例鼻咽癌组织和20例鼻咽正常组织的表达量,同时检测它在3株鼻咽癌细胞6-10B,9-4E,CNE2和1株鼻咽正常上皮细胞NP69中的表达量。MTT和克隆形成实验用来检测miR-494对鼻咽癌细胞增殖的影响;Transwell和划痕实验用来验证miR-494对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响;流式细胞术检测miR-494对鼻咽癌细胞凋亡的的影响;双荧光素酶报告载体实验用来验证miR-494发挥作用的可能靶点;最后用qRT-PCR和western blot实验分别在mRNA水平和蛋白水平对靶基因进一步验证。 结果:MiR-494表达量在鼻咽癌组织较正常鼻咽组织下调,细胞中的表达情况与临床组织一致,鼻咽癌6-10B,9-4E和CNE2细胞中miR-494表达量均较鼻咽正常上皮细胞NP69低(p=0.001,p=0.001,p=0.001)。 荧光显微镜下观察细胞转染效率均达90%以上;6-10B,9-4E和CNE2细胞转染miR-494 mimic后 qRT-PCR检测显示 miR-494明显过表达(p<0.001,p=0.045,p=0.001),转染miR-494 inhibitor后,miR-494明显被敲低(p=0.019,p=0.005,p=0.010)。 MTT检测显示与对照组相比,miR-494 mimic对鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2在24h,48h和72h时的增殖抑制率分别为7.9%(24h)、15.9%(48h)、25.0%(72h)(p<0.001);11.8%(24h)、16.2%(48h)、15.9%(72h)(p=0.048);10.1%(24h)、15.7%(48h)、23.5%(72h)(p<0.001);miR-494 inhibitor对鼻咽癌细胞的增殖促进率分别为14.3%(24h)、20.0%(48h)、18.0%(72h)(6-10B)(p=0.006);11.4%(24h)、16.4%(48h)、20.1%(72h)(9-4E)(p<0.001);20.9%(24h)、34.2%(48h)、31.1%(72h)(CNE2)(p=0.001)。克隆形成实验中,miR-494 mimic使得6-10B、9-4E和CNE2三株鼻咽癌细胞克隆云集块少且小,抑制率分别为59.1%(p=0.017)、59.3%(p=0.013)和51.1%(p=0.012);miR-494 inhibitor使得6-10B、9-4E和CNE2细胞克隆云集块多且大,促进率分别为145.4%(p<0.001)、57.6%(p=0.012)和93.3%(p=0.003)。 Transwell迁移实验显示,miR-494 mimic对鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2在48h后迁移抑制率分别为40.5%(p=0.005)、59.5%(p=0.009)和26.3%(p=0.006);miR-494 inhibitor对鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2在48h后迁移促进率分别为145.9%(p<0.001)、128.3%(p<0.001)和135.8%(p=0.003)。同样,细胞划痕实验显示miR-494 mimic对鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2在24h后迁移抑制率分别为41.2%(p<0.001)、43.6%(p=0.042)和39.9%(p=0.004);miR-494 inhibitor对鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2在24h后迁移促进率分别为121.7%(p=0.004)、58.2%(p=0.004)和64.8%(p=0.031)。Transwell侵袭实验发现与对照组相比,转染了miR-494 mimic的鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2中细胞侵袭的抑制率分别是44.3%(p<0.001)、62.8%(p=0.029)和62.8%(p=0.013);转染了miR-494 inhibitor的鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2中细胞侵袭的促进率分别是209.1%(p=0.001)、71.8%(p<0.001)和110.6%(p=0.049)。 流式细胞术实验显示转染miR-494 mimic的鼻咽癌细胞和对照组细胞的凋亡率分别为20.2%vs4.1%(6-10B,p=0.004),15.6%vs6.2%(CNE2,p=0.019)和1.6%vs1.3%(9-4E,p=0.783);6-10B,9-4E和CNE2转染miR-494 inhibitor的鼻咽癌细胞和对照组细胞凋亡率分别为9.3%vs9.2%(p=0.956),2.4%vs3.0%(p=0.554)和9.7%vs10.6%(p=0.686)。 构建荧光素酶报告载体后与miR-494 mimic共转染,与对照组相比,鼻咽癌细胞6-10B、9-4E和CNE2细胞中GALNT7和CDK16的活性被敲低(GALNT7,p=0.030,p<0.001,p=0.026)(CDK16,p=0.013,p=0.034,p=0.018);共转染miR-494 inhibitor,鼻咽癌细胞中GALNT7和CDK16活性无明显改变;构建的相应的突变体后再与miR-494 mimic、miR-494 inhibitor分别共转染后发现其活性与对照组相比也未见明显差异。QRT-PCR显示miR-494过表达后GALNT7和CDK16在mRNA水平下降。Western blot实验证实miR-494 mimic明显下调GALNT7和CDK16的蛋白水平表达,miR-494 inhibitor对GALNT7和CDK16蛋白水平表达的影响未见明显差异。 结论:MiR-494表达量在鼻咽癌组织较鼻咽正常组织下调,鼻咽癌细胞6-10B,9-4E和CNE2中miR-494较正常鼻咽上皮细胞表达下调。MiR-494的过表达可抑制鼻咽癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭,促进细胞的凋亡;敲低miR-494可促进鼻咽癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭,细胞凋亡未见明显影响。GALNT7和CDK16被证实为miR-494的直接作用靶点,miR-494通过抑制GALNT7和CDK16在鼻咽癌mRNA水平和蛋白水平的表达来发挥作用。本研究表明,miR-494在鼻咽癌中通过靶向作用GALNT7和CDK16发挥抑癌基因作用。