白藜芦醇减弱山羊小肠上皮细胞热应激反应的功能与机制研究

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小肠是应激反应的中心器官,也是营养物质消化吸收的主要场所,外界高温应激会导致肠粘膜严重损伤。研究怎样降低热应激诱导的小肠黏膜损伤,有利于保证小肠黏腹结构和功能的完整性。通过増加饲料报酬,提高动物生长性能,有利于减少热应激给畜牧业造成的巨大经济损失。本研究通过体外建立山羊小肠上皮细胞(GIE)热应激模型,应用白藜芦醇(RES)预处理,探索其能否保护山羊小肠上皮细胞抵御热应激损伤。结合分子生物学手段探索白藜芦醇在山羊小肠上皮细胞中发挥抗氧化、抗炎作用的分子机理,以期为后期饲料研发提供科学依据。试验一白藜芦醇对热应激损伤的GIE细胞抗氧化能力和HSP70表达的影响本试验采用生长良好的第4代小肠上皮细胞,分为空白对照组(37℃)、热应激组(42℃)、42℃热应激加白藜芦醇组(5、15、30μmol·L-1);加药预处理6 h后进行热应激处理6 h。通过CCK-8法检测白藜芦醇细胞毒性;采用生化法和流式细胞术检测白藜芦醇对热应激诱导的抗氧化性能的影响;利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测白藜芦醇对热应激诱导的HSP70基因转录的影响。结果表明:白藜芦醇预处理GIE细胞后可显著增加总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力(P<0.01),抑制丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)生成(P<0.01),同时降低HSP70基因表达(P<0.01),从而抑制热应激诱导的GIE细胞氧化应激。试验二白藜芦醇对热应激损伤的GIE细胞免疫因子转录的影响本试验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白藜芦醇对热应激诱导的细胞因子分泌的影响;利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测白藜芦醇对热应激诱导的白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素8(IL-8)和核转录因子-κB(NF-κB)基因转录的影响。结果表明:白藜芦醇通过抑制热应激诱导的山羊小肠上皮细胞中IL-1β、TNF-α、IL-8和NF-κB的基因转录(P<0.01),降低了IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌(P<0.01)。试验三白藜芦醇激活PI3K/AKT-Nrf2/HO-1增强细胞抗氧化能力本试验用Western blot检测白藜芦醇处理GIE细胞不同浓度(0、5、15、30μmol·L-1)和不同时间(0、1、3、6、9、12 h)后HO-1、Nrf2、PAKT、AKT、PCDA、GAPDH等蛋白的表达,利用CCK-8法和流式细胞术检测AKT抑制剂和白藜芦醇预处理GIE细胞后的细胞活力和细胞凋亡情况。结果表明:白藜芦醇可以显著促进HO-1表达、Nrf2入核及AKT磷酸化,且呈剂量和时间依赖性。在加入AKT抑制剂处理后,Nrf2核移位、HO-1表达量和AKT磷酸化均极显著降低,同时GIE细胞热应激后,白藜芦醇保护细胞作用受阻,表明白藜芦醇通过PI3K/AKT-Nrf2/HO-1信号通路来抵御热应激诱导的GIE细胞氧化应激损伤。
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