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对于畜牧养殖公司来说,饲料利用率仍然是一个值得关注的重要指标之一。饲养初期,肉鸡的饲料利用率低导致线粒体呼吸链复合物的活性降低、蛋白氧化增强,所以了解调控线粒体数量的分子机制来提高饲料利用率,为改善家禽的生产性能提供一个方向。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)通过整合细胞内外各种信号来参与蛋白质合成和脂质合成,还在线粒体的代谢过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明m TOR参与线粒体生物合成(如:氧化磷酸化、三羧酸循环)、动力学(线粒体的融合与分裂)等功能。此外,属于I型的蛋白质精氨酸甲基转移酶1(Protein arginine methyltransferase 1,PRMT1)除了催化蛋白质精氨酸的甲基化外,还可以通过PGC-1a调控线粒体的质量。基于前人研究,本试验旨在探究m TOR和PRMT1对线粒体数量的调控机制,主要分为3个部分:(1)首先分析饥饿肝脏组织和LO2细胞中mi R21、m TOR和PRMT1的基础表达和线粒体数量;(2)进而探究m TOR是否调控PRMT1表达和线粒体数量及如何调控;(3)并研究饥饿处理后胰岛素的添加对m TOR/PRMT1信号通路和线粒体数量的影响。本试验的研究结果为维持能量稳态提供有效的分子靶点。试验一饥饿模型中mi R21、m TOR和PRMT1的基础表达将生长生理状况相近的8周龄C57BL/6J小鼠随机分成对照组(4只)、饥饿24 h组(3只)、饥饿48 h组(3只)三组,自由饮水,采集各组小鼠的肝脏分别提取RNA和蛋白;同时在细胞试验中,待LO2细胞密度达到80%后无血清培养24 h、48 h,对照组加入等体积的完全培养基培养。结果显示饥饿48 h组的C57BL/6J小鼠体重显著降低(P<0.01),小鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)和乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)的含量显著升高(P<0.05),表明肝细胞受损。此外,与对照组相比,饥饿48 h组的肝脏mi R21、m TOR、PRMT1表达显著下调(P<0.01),细胞试验结果显示无血清培养48 h的LO2细胞中mi R21、m TOR、PRMT1表达也显著降低(P<0.01)。因此在体和离体试验表明饥饿处理组中mi R21基因表达显著下调、m TOR和PRMT1的蛋白水平显著下调。试验二m TOR调控PRMT1表达和线粒体数量的分子机制在试验一的基础上,为了研究m TOR是否调控PRMT1,采用m TOR的si RNA(40n M)转染LO2细胞48 h或特异性抑制剂-雷帕霉素(Rapamycin,Rap)10 n M刺激LO2细胞24 h,用蛋白质免疫印迹法检测PRMT1的表达情况;线粒体绿色荧光探针染色检测活细胞中线粒体的数量。结果表明,抑制m TOR表达或者活性后,PRMT1表达显著下调(p<0.01)、线粒体数量减少,可见m TOR调控PRMT1表达和线粒体生物的合成。为进一步探究m TOR如何调控PRMT1,待LO2细胞密度汇合至80%后进行无血清培养24 h、48 h,对照组用等体积的完全培养基培养,用蛋白质免疫印迹法检测各处理组细胞蛋白样品中STAT1、p-STAT1蛋白的表达情况。结果发现无血清培养48 h后STAT1、p-STAT1蛋白表达显著下调(P<0.05),并且STAT1结合PRMT1启动子区域的能力显著降低(P<0.05);在p-STAT1蛋白变化与m TOR、PRMT1蛋白变化一致的基础上,采用si-m TOR(40 n M)转染LO2细胞48 h或Rap(10 n M)刺激LO2细胞24h,检测对照组和处理组细胞蛋白样品中STAT1、p-STAT1蛋白的表达情况。结果显示,抑制m TOR表达或活性后,p-STAT1蛋白表达明显降低(P<0.05),可见m TOR调控STAT1表达;为进一步研究STAT1和PRMT1的上下游关系,采用si-STAT1(50n M)转染LO2细胞48 h,用蛋白质免疫印迹法检测PRMT1的表达。结果发现,抑制STAT1后,PRMT1表达显著下调(P<0.01),由此得出STAT1调节PRMT1表达;基于前期探究,在LO2细胞中转染PRMT1-si RNA或PC3.1-PRMT1后,用蛋白质印迹法检测PPARγ的变化情况;线粒体绿色荧光探针染色检测线粒体的数量。结果表明,抑制PRMT1或过表达PRMT1,PPARγ表达显著降低(P<0.001)或升高(P<0.05)、线粒体的数量减少或增加。由此可见,m TOR通过磷酸化的STAT1调节PRMT1的表达和线粒体数量。试验三胰岛素挽救m TOR/PRMT1信号通路并影响线粒体数量在试验一和试验二的基础上,待LO2细胞无血清培养48 h后添加100n M的胰岛素(Insulin)30 min,从蛋白表达、线粒体数量变化这两个方面探究无血清处理LO2细胞48h后添加胰岛素对m TOR/PRMT1信号通路蛋白及线粒体数量的影响。结果发现,与无血清处理LO2细胞48 h组相比,无血清处理LO2细胞48h后添加胰岛素组的m TOR/PRMT1信号通路中p-m TOR(P<0.05)、p-STAT1(P<0.01)、PRMT1(P<0.01)和PPARγ(P<0.05)蛋白表达均显著升高、线粒体数量也有所增多。因此无血清处理LO2细胞48 h后胰岛素的添加可以刺激m TOR-PRMT1信号通路中的相关蛋白的表达并增加线粒体数量。本试验研究发现调节线粒体数量的一种新信号机制,在体和离体的饥饿模型下,mi R21、m TOR和PRMT1表达均下调,并且m TOR通过p-STAT1调节PRMT1,进而调控PPARγ表达和线粒体数量。此外,无血清处理后胰岛素的添加能够激活m TOR通过增强STAT1的磷酸化来改善线粒体数量。可见m TOR和PRMT1在调节线粒体数量过程中都发挥着关键作用,这些发现为维持能量稳态提供有效的分子靶点。