论文部分内容阅读
玉米是杂种优势利用中最为普遍的一类作物,而利用雄性不育系是玉米杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的一种重要手段。但由于玉米C型胞质雄性不育产生的分子机理极其复杂,其不育机制至今尚未明确。本研究对玉米C型胞质雄性不育的候选基因进行了初步的功能分析,主要结论有以下几个方面:1.玉米C型胞质不育系中的atp9、atp6-C及cox2-C均是重组基因,其中atp9基因是非编码区发生重组。不育系中atp6-C基因5’端的39bp与atp9基因5’端的39 bp具有同源性,只在第15个碱基处存在SNP;atp6-C基因中部是由442bp未知来源区域组成;atp6-C基因3′端的764 bp与保持系atp6基因3’端的764bp具有高度同源性,只存在2个SNP。cox2-C基因由三部分组成,第一部分与保持系atp6基因5’端的440bp相同;第二部分是保持系atp6基因与cox2基因上游同源序列的111bp加上cox2基因7bp的特异序列,共118bp;第三部分与cox2基因1577bp具有高度同源性,内含子部分存在2个碱基的差异。atp6-C与cox2-C这两个基因的mRNA均存在C-U的RNA编辑现象,且两者均存在跨膜结构域。2.基因环化PCR结果表明,不育系二分体花药中atp9基因只有一条转录本,而atp6-C和cox2-C均至少存在4种转录本。此外,我们通过Northern blot实验也证实这一结果,并且发现F1中不育基因的转录受细胞核恢复基因的影响。Real-time qPCR结果表明atp6-C与cox2-C均为组成型表达,且在不育系花药二分体、单核和根中的表达量均明显高于F1。3.将构建好的瞬时表达载体通过PEG介导的方法转化玉米原生质体,并用线粒体染料MitoTracker?Red CMXRos对原生质体染色,在激光共聚焦显微镜下进行观察,发现绿色荧光和红色荧光重叠,表明了atp6-C与cox2-C均定位在线粒体上。4.构建含有GFP标签的植物表达载体并转化拟南芥,观察阳性植株未发现完全败育的情况。将相同载体转化烟草后观察空载体及mts可以正常表达,而连有atp6-C与cox2-C的表达载体GFP的荧光信号很弱,说明了GFP可能影响了目的基因的表达,也可能导致花粉败育的原因是短的转录本或其他线粒体基因。