研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种慢性、退行性关节疾病,给患者的生活质量带来严重威胁。近年来,OA患病人群大幅增加,给家庭、社会和医疗健康系统造成巨大的经济压力。然而在临床上对骨关节炎仍缺乏有效的药物干预手段。因此,深入理解致病机理对于骨关节炎的综合防治十分必要。关节软骨损伤是骨关节炎的核心病理特征。软骨基质的主要成分蛋白聚糖和胶原蛋白以及软骨细胞内的糖脂类小分子等均是硫酸化修饰的重要底物,而且硫酸化修饰对于它们维持正常的生物学功能至关重要。因此,为了确保细胞内硫酸化修饰的正常进行,软骨细胞对于SO42-的需求极高。硫酸根转运蛋白SLC26A2介导的SO42-转运是软骨细胞摄取SO42-的主要途径。因此,SLC26A2蛋白对于软骨细胞稳态具有关键的调控作用。现已证实,SLC26A2功能缺失严重影响生长板软骨发育,导致多种骨软骨发育不良疾病。然而目前SLC26A2在关节软骨稳态中的作用尚未阐明。近年来,有研究团队证实25-羟化胆固醇（25-hydroxycholesterol,25-HC）这一胆固醇活性代谢产物是骨关节炎的重要致病分子。更重要的是,大量研究发现25-HC的硫酸化修饰形式3-硫酸-25-羟化胆固醇（25-hydroxycholesterol-3-sulfate,25-HC3S）的生物学功能在脂质代谢和炎症反应调节上与其功能恰恰相反。因此,我们猜测25-HC的硫酸化修饰异常造成25-HC3S含量降低也可能是骨关节炎的重要发病机制。研究目的本研究首先通过构建多种骨关节炎模型和SLC26A2功能缺失模型,明确在骨关节炎疾病进程中SLC26A2在软骨细胞中的表达变化以及SLC26A2功能缺失是否为骨关节炎的重要致病因素。其次,本研究通过RNA-seq技术手段以及小鼠模型构建,阐明SLC26A2功能缺失诱发骨关节炎的致病机制。最后,寻找具有潜力的治疗药物。研究方法1)在DMM手术诱导的小鼠骨关节炎模型以及IL-1β刺激的小鼠原代软骨细胞中,采用番红O-固绿染色、免疫荧光（IF）、实时定量PCR以及Western Blot等实验技术评估骨关节炎的严重程度,并检测硫酸根转运蛋白SLC26A2的表达情况,计算SLC26A2阳性细胞比例。同时构建多种SLC26A2功能缺失模型,包括原代软骨细胞Slc26a2基因敲除模型和DIDS抑制股骨头软骨SLC26A2功能这两种体外模型以及Slc26a2fl/fl小鼠（关节腔注射AAV5-Cre以敲除软骨细胞Slc26a2基因）和Col2α1-Cre ERT2;Slc26a2fl/fl小鼠（腹腔注射他莫昔芬（Tamoxifen,TM）诱导软骨特异性Slc26a2基因敲除）这两种体内模型,采用HE染色、番红O-固绿染色、免疫荧光（IF）、实时定量PCR和Western Blot等手段,评估软骨细胞基质合成/分解代谢状态以及关节软骨退变表型。2)利用RNA-seq技术分析SLC26A2功能缺失时软骨细胞的差异基因表达情况,筛选出潜在的致病通路。随后,在敲除Slc26a2基因的原代软骨细胞中,通过实时定量PCR和Western Blot等实验方法,检测通路相关指标。最后通过构建相关小鼠模型在体验证致病信号通路。3)基于上述实验结果,进一步评估25-HC3S对骨关节炎的治疗效果,将25-HC3S注射到手术诱导的骨关节炎小鼠的膝关节腔中,采用番红O-固绿染色、免疫荧光（IF）和micro CT等手段,对比分析治疗组与非治疗组关节软骨的损伤程度、细胞的分解代谢状态以及关节骨赘的体积和数量。研究结果1)小鼠退变关节软骨组织的番红O-固绿与免疫荧光染色结果显示随着骨关节炎严重程度增加,SLC26A2阳性细胞比例显著降低。同时小鼠原代软骨细胞在IL-1β的刺激下,软骨细胞的基质合成与分解代谢紊乱,SLC26A2表达水平显著下调。同时,SLC26A2功能缺失体外模型的实验结果显示SLC26A2功能缺失导致软骨细胞肥大分化进程加速以及基质合成与分解代谢紊乱。SLC26A2功能缺失体内模型的实验结果显示敲除Slc26a2基因后关节软骨番红O严重丢失,组织出现大块缺损,OARSI评分显著升高以及软骨细胞基质合成与分解代谢紊乱。2)RNA-seq数据显示SLC26A2功能缺失时脂质合成相关基因的表达相对上调,其中SREBP1c的靶基因Fasn、Acaca和Scd1等表达均明显上调,提示SREBP1c的转录活性增强。Slc26a2基因敲除的原代软骨细胞的荧光定量PCR和Western Blot的实验结果也表明SREBP1c以及其重要的上游调控因子LXR的转录活性均明显增强。中性脂质探针Bodipy 493/503的染色结果显示SLC26A2功能缺失的软骨细胞出现明显的中性脂质蓄积表现。鉴于SLC26A2功能缺失时胆固醇的硫酸化修饰出现异常,而25-HC3S具有缓解脂质蓄积的药理功能,我们推测25-HC3S含量降低可能是SLC26A2功能缺失导致脂质蓄积的重要原因。我们构建的胆固醇硫酸化修饰异常小鼠模型关节软骨出现明显的脂质蓄积表现以及严重的骨关节炎表型。而且25-HC3S能够一定程度上缓解DIDS处理的关节软骨细胞的脂质蓄积和关节退变表现,印证了上述猜想。3)在关节腔注射25-HC3S进行治疗后,骨关节炎小鼠的关节软骨细胞中性脂质合成减少,同时关节软骨OARSI评分明显降低,基质分解酶MMP13表达明显下调,骨赘体积减小和数量减少。研究结论综上,我们明确SLC26A2功能缺失造成的硫酸化修饰不足是导致骨关节炎的重要因素。而软骨细胞乏硫所致的细胞中性脂质蓄积是其中的重要致病机理。由此,我们发现了一种小分子药物25-HC3S有望成为骨关节炎的治疗药物。