背景:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的发病率逐年升高,尚无有效的治疗手段。根据病理阶段的不同,SCI可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指由外界暴力因素直接引起的脊柱脊髓连续性中断,其过程往往是不可逆的,因此减轻甚至逆转继发性损伤对于SCI修复至关重要。作为先天性免疫细胞,小胶质细胞和星形胶质细胞广泛分布于整个中枢神经系统（central nervous system,CNS）,在SCI病理和修复过程中发挥重要作用。根据病理刺激因素的不同,小胶质细胞和星形胶质细胞可能呈现不同的激活状态,大致可分为神经毒性表型和神经保护性表型,对损伤或疾病进展有着不同的影响。因此调控小胶质细胞和星形胶质细胞不同表型转换,成为CNS研究的重点之一。光生物治疗（Photobiomodulation,PBM）,又被称作低水平激光疗法（low-level laser therapy,LLLT）,是指利用低水平激光以特定波长照射组织,通过激活细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase,CCO）,增强线粒体功能,改善血液循环流动和组织能量代谢。我们团队以往的研究表明,PBM能够调控SCI后骨髓源性巨噬细胞极化,抑制胶质瘢痕形成。然而先前对于PBM治疗脊髓损伤的方式仅局限于经损伤区皮肤间接进行照射,造成光能被动散射和组织吸收耗损严重,因此我们开发了一种可植入式激光光纤,能够在体内进行埋置,PBM的有效剂量直接投射在受损脊髓表面,其可行性和安全性已在大动物模型上得到验证。在本研究中,我们旨在验证改进后PBM治疗SCI的有效性以及探索PBM作用的潜在机制,着重于关注PBM对SCI后小胶质细胞和星形胶质细胞活化的影响。方法:在体内实验中,选用Sprague-Dawley雄性大鼠将其随机分为三组:假手术组（sham组）,单纯损伤组（SCI+vehicle组）和损伤治疗组（SCI+PBM组）。建立脊髓钳夹挫伤模型后,在SCI+vehicle组和SCI+PBM组中大鼠的椎旁软组织缝合固定激光光纤,对SCI+PBM组中的大鼠进行连续两周的PBM治疗。在造模后不同天数,采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分量表、Louisville Swim Scale（LSS）评分量表和足印记实验评估运动功能恢复情况,利用GFAP免疫荧光染色测量受损脊髓空洞面积,通过TUNEL检测受损脊髓组织的凋亡水平,利用Neu N免疫荧光染色计数神经元存活数量。采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot、ELISA等技术手段综合分析小胶质细胞和星形胶质细胞在SCI后不同阶段的活化水平,以及探索PBM对于其神经毒性表型活化的影响。在体外实验中,提取培养小胶质细胞和星形胶质细胞,利用LPS和γ-IFN诱导神经毒性小胶质细胞活化,利用C1q、TNF-α和IL-1α诱导神经毒性星形胶质细胞活化,并构建PBM体外照射细胞模型。为明确诱导后小胶质细胞和星形胶质细胞的神经毒性,分别收集二者培养基上清液加入脊髓前角运动神经元瘤细胞系（VSC 4.1）中,进行流式细胞术分析凋亡水平。对受损脊髓组织进行RNA-Seq以探究神经毒性小胶质细胞和星形胶质细胞活化机制。在体外实验中,PBM联合应用cucurbitacin I（JAK2-STAT3通路抑制剂）、腺相关病毒转染（AAV-sh RNA-Lcn2）和重组蛋白Lcn2（Re Lcn2）,检测诱导后神经毒性胶质细胞的活化水平。接下来,对SCI后星形胶质细胞不同表型的活化机制进行初步探索。利用GO分析和KEGG通路富集分析,发掘参与星形胶质细胞不同表型活化可能相关的信号通路,并作为PBM发挥调控星形胶质细胞表型转变的潜在靶点,分别在体内外进行验证。此外,采用特异性信号通路抑制剂以及重组蛋白进行体外实验,以验证b FGF和TGF-β在PBM调控A1/A2不同表型活化中的作用,并利用原代培养DRG神经元生长状况证明不同表型星形胶质细胞对神经元的影响。结果:本研究中,我们发现可植入式激光光纤埋置在SCI大鼠脊椎旁软组织具有可行性。利用BBB评分,LSS量表和足印记实验综合分析表明,PBM能够在SCI后第7天促进运动功能恢复。GFAP免疫荧光染色显示PBM在SCI后第28天减小损伤空洞面积。TUNEL检测显示PBM在SCI急性期降低SCI后脊髓组织的凋亡水平。Neu N免疫荧光染色显示PBM在SCI亚急性期减少损伤旁区脊髓组织的神经元死亡。此外,我们发现PBM能够调控SCI后小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,且调控具有时程性:在SCI急性期,PBM抑制主要参与炎症反应的小胶质细胞活化,减少其向损伤中心募集的数量,降低其神经毒性表型标记物i NOS的表达水平,改变其不同形态细胞比例;在SCI后亚急性期,PBM抑制星形胶质细胞的活化,降低C1q、TNF-α和IL-1α蛋白表达水平,减少神经毒性星形胶质细胞的数量。进一步实验表明,PBM同样抑制体外诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞活化,减少其对于VSC 4.1的毒性作用。Lcn2和JAK2-STAT3通路在SCI后表达时程具有一致性,且能被PBM同步抑制。在体外实验中,PBM联合应用cucurbitacin I增强PBM对诱导活化的小胶质细胞和星形胶质细胞的抑制作用,干扰Lcn2表达增强PBM对小胶质细胞和星形胶质细胞的抑制作用,而Lcn2重组蛋白则降低PBM的作用效果。星形胶质细胞在SCI后急性期便从静止状态向反应状态逐渐活化,从第7天开始明显上调表达A1表型相关基因,而A2表型相关基因上调发生得更早,但程度相对较低,并逐渐减弱。在体内实验和体外实验中,PBM均能抑制A1型星形胶质细胞相关基因表达,促进A2型星形胶质细胞相关基因表达。GO分析和KEGG通路富集分析显示在SCI后第7天,炎症反应和免疫应答系统过程显著改变。NF-κB通路、Notch通路、PI3K-Akt通路和JAK-STAT通路参与到A1/A2星形胶质细胞表型转变过程,且PBM不同程度调控上述信号通路激活。此外,PBM促进SCI后的b FGF和TGF-β的表达水平上调以及体外培养的星形胶质细胞合成分泌b FGF和TGF-β增多,且二者均能调控A1/A2星形胶质细胞表型转变。同时,PBM能够减轻A1型星形胶质细胞对DRG神经元的毒性作用。结论:1.体内埋置激光光纤进行PBM治疗SCI,具有可行性和有效性。2.PBM能够减轻SCI继发性损伤,减轻神经炎症反应,降低组织凋亡水平,增强神经元存活的能力,减小受损脊髓空洞面积,促进运动功能恢复。3.PBM具有时程性地调控SCI后小胶质细胞和星形胶质细胞的特点:急性期抑制小胶质细胞活化,亚急性期抑制星形胶质细胞活化。4.“Lcn2/JAK2-STAT3 crosstalk”参与到神经毒性胶质细胞活化中,并作为PBM干预的靶点。5.PBM能够调控SCI后A1/A2星形胶质细胞表型转变,其机制与部分参与炎症反应和免疫应答的信号通路有关,此外b FGF和TGF-β也参与其中。