研究背景和目的:创面的处理是临床工作中经常遇到的问题。创面愈合是一个复杂而动态的生理过程,且影响创面愈合的因素诸多。感染是皮肤屏障破坏后创面修复首先要应对的问题,也是影响创面愈合的重要因素之一。局部消毒剂在创面治疗中被广泛使用。随着我国医疗美容的快速发展,整形外科对创面愈合的质量也更加重视。因此,我们急需一种抗菌效果好,对创面愈合影响小的消毒剂。聚维酮碘（Povidone Iodine,PVP-I）、过氧化氢（Hydrogen Peroxide,H2O2）、葡萄糖酸氯己定（Chlorhexidine Gluconate,CHG）和苯扎溴铵（Benzalkonium bromide,BB）是临床创面治疗中常用的几种局部消毒剂。目前,局部消毒剂的体外毒性已经逐渐被人们所认知,但人体是一个完整的有机体,所以局部消毒剂对创面愈合的影响及作用机制仍需要进一步明确。因此,本研究的主要目的是探究临床常用局部消毒剂对创面愈合的影响以及这些消毒剂的抗菌效果如何,并进一步明确它们是如何影响创面愈合的。实验研究方法:1.通过SD大鼠全层皮肤缺损创面模型宏观评估不同局部消毒剂对创面愈合的影响。通过在SD大鼠背部打孔的方式制造全层皮肤缺损创面模型。对照组使用生理盐水（Normal Saline,NS）,其余三组分别使用2g/L BB、0.5g/L PVP-I和0.2%CHG每日冲洗创面一次并拍照。使用Image J（v1.53c）软件测量SD大鼠的创面面积并计算愈合率。2.通过组织病理及免疫组化的方法微观评估不同局部消毒剂对SD大鼠创面愈合的影响。在创面造模后的第9天取各组创面组织。对组织进行HE染色和Masson染色,从炎症、再上皮化、肉芽组织数量、新生血管和胶原沉积五个方面进行组织病理学评估。使用TUNEL法对各组创面组织进行细胞凋亡检测。使用免疫组化法检测创面组织中的核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）的表达水平。3.通过细菌培养及菌落计数评估不同局部消毒剂的抗菌效果。在创面造模后6小时对各组SD大鼠创面进行抗菌效果评价,评价方法依据GB 27951-2011关于皮肤消毒剂卫生要求的国家标准进行。在创面愈合的第6天,我们再次对创面取样,并进行创面分泌物培养并进行质谱分析检测。4.通过CCK-8法检测不同消毒剂对人永生化角质形成细胞（Human immortalized keratinocytes,Ha Cat）活性的抑制浓度。使用CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒检测BB、PVP-I和CHG在不同浓度下对Ha Cat细胞的毒性。根据细胞活力和药物的浓度值绘制抑制率曲线并计算IC25、IC50、IC75值。5.通过H2DCFDA探针检测不同局部消毒剂作用下的Ha Cat细胞活性氧水平。分别使用IC25、IC50、IC75浓度的BB、PVP-I和CHG孵育Ha Cat细胞4小时,随后使用H2DCFDA探针通过流式细胞仪检测Ha Cat细胞内的活性氧水平。6.通过免疫荧光法检测Ha Cat细胞中的Nrf2蛋白核转位。分别使用IC25、IC50、IC75浓度的BB、PVP-I和CHG孵育Ha Cat细胞4小时后,使用p Nrf2抗体及荧光二抗孵育细胞。在共聚焦显微镜下观察Nrf2蛋白与细胞核的共定位情况。7.通过免疫印迹法检测Ha Cat细胞中的Nrf2及血红素氧合酶1（Heme Oxygenase 1,HO-1）的表达情况。分别使用IC25、IC50、IC75浓度的BB、PVP-I和CHG孵育Ha Cat细胞4小时后提取细胞蛋白进行免疫印迹检测。8.通过CCK-8法检测H2O2对Ha Cat细胞增殖的影响。使用不同浓度的H2O2孵育细胞24小时,随后使用CCK-8试剂盒检测Ha Cat细胞的增殖情况。9.Nrf2在低浓度H2O2促进Ha Cat细胞增殖中的作用。将Ha Cat细胞分为三组,第一组,使用终浓度为5μmol/L的Nrf2抑制剂ML385预孵育细胞2小时,随后使用含35μmol/L H2O2的完全培养基37℃孵育24小时。第二组,仅使用含35μmol/L H2O2的完全培养基37℃孵育24小时。第三组,使用含有0.9%氯化钠的完全培养基37℃孵育24小时,作为对照组。随后使用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖活性。使用免疫荧光法检测各组Ha Cat细胞的Nrf2核转位情况。使用H2DCFDA探针检测各组Ha Cat细胞中的活性氧水平。10.通过SD大鼠全层皮肤缺损创面模型评价不同浓度H2O2对创面愈合的影响。将SD大鼠分为3组,对照组使用NS,0.01%H2O2组和3%H2O2组分别使用0.01%H2O2和3%H2O2,于创面造模后每日一次冲洗创面并拍照记录创面愈合情况。取创面造模后第3、6、9、12、15、18天的创面组织进行HE染色。实验结果:1.BB、PVP-I和CHG均不同程度的延迟了SD大鼠的创面愈合。2.在第9天的创面组织中NS处理的创面组织在炎症、再上皮化、肉芽组织数量、新生血管和胶原沉积等方面均比BB、PVP-I和CHG组表现要好。BB组的组织病理学评分最低。BB导致创面组织细胞凋亡最多。BB处理的大鼠创面中Nrf2出现高表达。此外,在使用30g/L BB处理大鼠创面时,大鼠创面及周围皮肤出现了严重损伤,并导致大面积表皮剥脱。3.NS、BB、PVP-I和CHG都取得了令人满意的抗感染效果,各组大鼠创面均未发生感染。各组局部消毒剂的杀菌率达到几乎100%,但NS冲洗同样达到了95%。4.与PVP-I和CHG相比,BB对Ha Cat细胞的细胞毒性更高,IC25、IC50和IC75最低,分别为1.90、4.16和9.09g/m L。5.BB可导致Ha Cat细胞的活性氧水平升高,并且具有浓度依赖性。6.与PVP-I和CHG相比,BB可更大程度的刺激Ha Cat细胞中的Nrf2激活,并使Ha Cat细胞出现凋亡。7.与NS组相比,经过IC25、IC50和IC75浓度的PVP-I、CHG和BB处理的Ha Cat细胞显示出Nrf2、p Nrf2和HO-1的表达上调。8.在25.92-43.2μmol/L的浓度范围内,H2O2可以促进Ha Cat细胞增殖。9.使用Nrf2的抑制剂ML385后H2O2促进Ha Cat细胞增殖的作用减弱,并且Ha Cat细胞中的Nrf2激活减弱活性氧水平增高。10.与NS组相比,0.01%的H2O2促进了SD大鼠的创面愈合,并使创面炎症期提前且缩短。实验结论:1.0.5g/L聚维酮碘、0.2%葡萄糖氯己定和2g/L苯扎溴铵均能起到良好的创面杀菌效果,但在不同程度上延迟了大鼠急性创面的愈合。30g/L苯扎溴铵可对创面及健康大鼠皮肤造成严重损伤。2.在同等抑制率浓度下,苯扎溴铵浓度对Ha Cat细胞有更高的致氧化应激作用,并可导致细胞凋亡。3.在25.92-43.2μmol/L的浓度范围内,过氧化氢可以促进Ha Cat细胞增殖,该作用与Nrf2的激活相关。0.01%的低浓度过氧化氢可促进大鼠创面愈合。