论文部分内容阅读
目的:利用慢病毒载体（Lentivirus vector,LV）构建人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC）过表达的WRL68细胞株,经微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR,MCLR）诱导细胞恶性转化,动态观察细胞的增殖、在体外形成克隆及在裸鼠体内形成肿瘤的变化情况,研究GCLC基因过表达对MCLR诱导肝细胞恶性转化的影响,探索MCLR致癌的相关机制。方法:1.慢病毒介导的稳定过表达人GCLC基因的WRL68细胞株构建（1）慢病毒载体构建及鉴定:采用PCR法合成GCLC基因片段,经过Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用酶切、测序的方法对重组质粒LV6-GCLC进行鉴定;（2）GCLC过表达稳转株的构建:将重组质粒及包装质粒共同转染293T细胞,收集培养上清进行病毒滴度测定后侵染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出GCLC稳定过表达细胞株。（3）GCLC过表达稳转株的鉴定:用Real-time PCR以及Western blotting方法鉴定所构建的GCLC过表达细胞株;用四甲基偶氮噻唑蓝[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide,MTT]检测GCLC过表达细胞活力;用酶联免疫吸附法检测细胞谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量。2.研究GCLC基因过表达对MCLR致WRL68细胞恶性转化的影响采用正常的WRL68细胞株和过表达GCLC基因的WRL68细胞株,设正常对照组、MCLR染毒组、空载组、空载染毒组、GCLC过表达组以及GCLC过表达染毒组。常规细胞培养,使各染毒组的细胞始终暴露于10nmol/L的MCLR,而正常对照组、空载组、GCLC过表达组则给予含0.01%DMSO的PBS进行处理,连续传代至第25代。采用MTT法、血清依赖实验检测细胞增殖情况,用软琼脂培养实验检测细胞锚着独立性生长情况,用裸鼠成瘤实验检测GCLC对成瘤性的影响,分别进行各组间的比较。结果:1.稳定过表达GCLC基因的WRL68细胞株构建（1）PCR电泳条带结果发现,GCLC基因扩增片段约1800bp,同时酶切结果显示,重组质粒LV6-GCLC电泳结果为8527bp,均与预期结果一致。测序结果也与Gen Bank中一致。（2）嘌呤毒素筛选实验确定嘌呤霉素最佳浓度为2μg/ml,慢病毒转染WRL68细胞72h后在荧光显微镜下可见大量绿色荧光。当慢病毒的滴度为1×10~9TU/ml时,WRL68细胞的侵染效率达到70%以上。（3）Real-time PCR及Western blotting结果显示,GCLC过表达组的GCLC m RNA及蛋白表达水平均显著高于正常对照组和空载组（P＜0.05）,而正常对照组的GCLC m RNA、蛋白表达水平与空载组比较,差异无统计学意义。（4）显微镜下对细胞进行形态学观察,发现GCLC过表达组细胞呈不规则四边形,贴壁生长,在形态上未发生明显改变。（5）MTT实验结果显示,正常对照组、空载组以及GCLC过表达组的细胞活力差异无统计学意义。（6）检测各组细胞内谷胱甘肽含量,GCLC过表达组细胞中GSH含量高于正常对照组及空载组（P＜0.01）,而正常对照组细胞GSH含量与空载组比较,差异无统计学意义。2.GCLC基因过表达对MCLR致WRL68细胞恶性转化的影响（1）在倒置光学显微镜下观察细胞的形态,发现正常对照组、空载组、GCLC过表达组细胞呈单层生长,排列有序,细胞核与细胞浆结构清晰。MCLR染毒组、空载染毒组、GCLC过表达染毒组则出现细胞核与细胞浆分界不清晰,长梭样改变,细胞大小差异不均,细胞边界不光滑,变得尖锐,有褶皱。（2）MTT结果显示,培养至72、96h时,MCLR染毒组细胞增殖速度快于正常对照组,空载染毒组、GCLC过表达染毒组细胞增殖速度快于空载组（P＜0.05）,GCLC过表达染毒组细胞增殖速度慢于空载染毒组（P＜0.05）。（3）血清依赖实验结果显示,培养至72、96h时,可以观察到MCLR染毒组、空载染毒组及GCLC过表达染毒组出现明显的血清不依赖性（P＜0.05）;培养至96h时,在含0.5%FBS的DMEM培养基中,与空载染毒组比较,GCLC过表达染毒组细胞血清不依赖性较弱（P＜0.05）。（4）软琼脂培养实验显示,第15、25代细胞均可观察到MCLR染毒组细胞克隆形成率高于正常对照组（P＜0.05）,空载染毒组、GCLC过表达染毒组细胞克隆形成率均高于空载组（P＜0.05）;第25代MCLR染毒组、空载染毒组、GCLC过表达染毒组细胞克隆形成率高于相应的第15代染毒组（P＜0.05）;第15、25代GCLC过表达染毒组细胞克隆形成率均低于空载染毒组（P＜0.05）。（5）裸鼠成瘤实验显示,接种第15代细胞的裸鼠均未出现肿瘤。而接种第25代MCLR染毒组、空载染毒组以及GCLC过表达染毒组细胞的裸鼠头颈部可以观察到肿瘤,三组肿瘤病理学检查结果均显示为分化程度低的肝细胞肝癌。GCLC过表达染毒组裸鼠瘤子的重量、体积均小于空载染毒组（P＜0.01）。结论:1.利用慢病毒介导的方法,首次成功构建了GCLC稳定过表达的WRL68细胞株。2.MCLR低剂量长期染毒可诱导人肝WRL68细胞发生恶性转化;GCLC过表达可部分抑制WRL68细胞增殖、锚着独立性生长以及裸鼠成瘤性,提示GCLC基因在抑制MCLR诱导的肝细胞恶性转化过程中可能发挥着重要作用。