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背景:子痫前期（pre-eclampsia,PE）是妊娠期20周以后出现的特发性高血压综合征,以高血压和蛋白尿为主要特征,尤其重度子痫前期（severe pre-eclampsia）可引 起多种妊娠期并发症,对母婴健康和生命安全造成了极大的损害和影响。PE的病因和发病机制尚不明确,但有研究认为,PE是一种以滋养细胞侵袭和迁移能力的缺陷所造成的子宫螺旋动脉重塑不足为其主要特征的胎盘源性疾病。然而,目前对于参与滋养细胞迁移和侵袭功能调控的潜在分子机制尚不明确。现有研究表明,虽然绝大多数的人类基因组被转录为蛋白,但只有2%具有编码功能。长链非编码核糖核酸（Long non-coding RNA,lncRNAs）最初被视为不具有特定功能的转录噪声,主要由聚合酶Ⅱ转录,长度＞200个核苷酸,不存在开放阅读框（ORF）。然而近年来的研究认为,lncRNAs已成为新的基因调控和协调因子,其通过作为表观遗传调控因子、分子支架、分子信号或诱饵,下调或诱导蛋白编码基因的过表达。LncRNAs的作用模式之一是与microRNAs（miRNAs）的相互作用,这种机制被称为竞争内源性RNA（ceRNAs）。lncRNAs通过吸附存在互补序列的miRNAs,释放miRNAs靶向的mRNA,作为ceRNAs。lncRNA和miRNA与广泛的生物学、生理和病理过程相关,如妊娠相关疾病。Opa相互作用蛋白5-反义转录物1（OIP5-AS1）位于15q15.1染色体上,是一种进化上保守的lncRNA,是斑马鱼转录本Cyrano的哺乳动物同源物,主要表达于细胞质中。据现有研究表明,OIP5-AS1是肿瘤生长和进展的关键调控因子:OIP5-AS1通过下调miR-129-5p使得其对SOX2（性别决定区Y-box2）靶向减少,进而抑制乳腺癌进展;在宫颈癌中,OIP5-AS1通过吸附miR-143-3p上调SMAD3和ITGA6的表达。然而,OIP5-AS1在PE发生发展中的作用并不明确。本研究初步分析显示,OIP5-AS1在滋养层细胞的化学缺氧模型中显著下调,而滋养细胞的缺氧模型是常见的体外PE模型;OIP5-AS1被发现包含一个保守的miR-29b结合位点;此外,在ITGB1（integrin β1）基因的3’-非编码区（3’-UTR）上发现了一个miR-29b结合位点。miR-29b和ITGB1被发现可能在滋养层细胞浸润、胎盘血管生成和促滋养细胞凋亡等PE的发病机制中起到关键作用。因此,本研究旨在探讨OIP5-AS1在滋养细胞迁移和侵袭功能中的作用及其可能的机制。并首次发现OIP5-AS1可能通过吸附miR-29b来上调ITGB1的表达,而miR-29b和ITGB1被认为是PE发病的关键基因。这些发现突出了OIP5-AS1在PE发病机制中的重要作用,并为该疾病的发展提供了新的前景。目的:1.探究OIP5-AS1、miR-29b和ITGB1在子痫前期患者胎盘组织中和正常胎盘组织中的表达差异;2.探究OIP5-AS1对滋养细胞迁移和侵袭能力的影响以及其分子生物学机制。实验方法:1.选取研究对象及采集标本:根据最新发布的《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》对重度子痫前期的定义,从郑州大学第三附属医院生物样本库选取了正常孕妇和重度子痫前期组患者胎盘组织样本,分为重度子痫前期组（severe pre-eclampsia,SPE）和正常组（Normal）,每组各 30 例样本。正常组为本院健康足月妊娠孕妇。为了避免分娩方式对研究结果可能造成的影响,例如经阴道分娩产生的感染等,本研究中SPE组和Normal组孕妇的分娩方式均为剖宫产。排除标准为:慢性高血压合并妊娠、妊娠期糖尿病、甲状腺功能减退、慢性肝炎、自身免疫性疾病、辅助生殖以及双胎妊娠等;2.使用 RT-qPCR 法检测OIP5-AS1、miR-29b 和 ITGB 1 在 SPE 组和 Normal组胎盘组织中的mRNA表达,并采用2-ΔΔCt相对定量法进行数据分析;3.使用Western blot法检测ITGB1在SPE组和Normal组胎盘组织中蛋白的相对表达量,然后用Image.J 1.53k图像处理软件进行定量分析;4.使用OIP5-AS1的小干扰RNA（si-OIP5-AS1）、miR-29b的模拟物和抑制物（hsa-miR-29b-mimic、hsa-miR-29b-inhibitor）及其各自的阴性对照（si-NC、mimic-NC 和 inhibitor-NC）转染滋养层细胞（HTR-8/SVneo）,通过 RT-qPCR法检测转染效率;5.转染成功后,通过RT-qPCR法检测si-OIP5-AS1对下游基因miR-29b的影响,以及转染miR-29b mimic和inhibitor后对OIP5-AS1和ITGB1的影响;6.使用氯化钴处理HTR-8/SVneo细胞,通过RT-qPCR法,检测不同浓度、不同时长氯化钴处理的条件下,OIP5-AS1的表达情况,使用CCK8法检测化学缺氧后HTR8/SVneo细胞的活性,根据结果确定化学缺氧模型的处理条件;7.成功建立化学缺氧模型后,通过划痕实验、Transwell侵袭实验观察缺氧对滋养细胞迁移和侵袭能力的影响;使用OIP5-AS1-pcDNA 3.1以及阴性对照（pcDNA 3.1 vector）转染缺氧后的HTR8/S Vneo细胞,再通过划痕实验、Transwell侵袭实验观察OIP5-AS1是否改变了缺氧对滋养细胞迁移和侵袭能力的影响;8.通过双荧光素酶实验验证OIP5-AS1和ITGB1的3’-UTR端存在miR-29b的结合位点;9.统计学分析:采用SPSS21.0和Graph Pad Prism 5.0统计分析软件进行相关数据分析,所有数据均用均数±标准差表示。两组定量资料的比较采用t检验或非参数检验。在所有数据分析中,p＜0.05为有差异具有统计学意义。结果:1.两组样本孕妇的基本临床资料比较两组结果显示,SPE组和Normal组间孕妇分娩年龄、孕前BMI的差异无统计学意义;SPE组收缩压、舒张压和24 h尿蛋白定量均高于Normal组,而分娩孕周则小于Normal组,差异有统计学意义且p＜0.01。2.两组新生儿情况比较两组结果显示,SPE组新生儿体重和胎盘重量均小于Normal组,差异有统计学意义且p＜0.01。3.OIP5-AS1、miR-29b和ITGB1在两组孕妇胎盘组织表达情况在mRNA水平上,重度子痫前期组（SPE）OIP5-AS1和ITGB1与正常（Normal）组相比在胎盘组织中表达较低（p＜0.01）,而miR-29b则表达较高,差异均有统计学意义;与Normal相比,SPE组ITGB1蛋白表达较低,且差异有统计学意义（p＜0.01）。4.模拟缺氧条件对滋养细胞迁移和侵袭的影响及对OIP5-AS1表达的影响在向细胞中加入氯化钴模拟缺氧环境后,CCK8结果显示,与空白对照组（Blank）相比,随着氯化钴浓度逐渐增高,且随着作用时间逐渐延长,HTR-8/SVneo细胞在24 h、48 h、72 h的增殖活性逐渐降低;与Blank组相比,当氯化钴浓度分别为125 μM、250 μM、500 μM时,RT-qPCR结果显示,HTR-8/SVneo细胞中OIP5-AS1的表达量逐渐下降,差异具有统计学意义。5.化学缺氧模型中转染OIP5-AS1后对细胞迁移、侵袭的影响根据CCK-8法和RT-qPCR检测结果确定使用加入氯化钴浓度为250 μM处理48 h作为条件进行后续实验。通过划痕实验检测发现,与Blank组相比,缺氧处理后的HTR-8/SVneo细胞迁移能力下降,Transwell侵袭实验显示HTR-8/SVneo细胞侵袭能力下降。与仅做缺氧处理组和阴性对照组相比,过表达OIP5-AS1后,通过划痕法检测发现HTR-8/SVneo细胞迁移能力增加,Transwell实验显示HTR-8/SVneo细胞侵袭能力提高。差异都具有统计学意义。6.过表达或沉默OIP5-AS1对miR-29b表达的影响与阴性对照组（vector）相比,过表达OIP5-AS1后,OIP5-AS1在mRNA水平上表达升高,而miR-29b表达降低;比与阴性对照组（OIP5-AS1-si-NC）相比,沉默OIP5-AS1后,OIP5-AS1在mRNA水平上表达降低,miR-29b在mRNA水平显著升高,差异有统计学意义。7.转染 miR-29b 后 miR-29b、OIP5-AS1、ITGB1 的表达情况miR-29b模拟物阴性对照组（miR-29b-mimics-NC）相比,RT-qPCR结果显示,转染miR-29b-mimics组的miR-29b表达量增高;而与转染miR-29b-inhibitor-NC组相比,miR-29b-inhibitor组miR-29b表达量大幅降低,差异有统计学意义;与阴性对照组（miR-29b-mimicsNC）相比,转染miR-29b-mimics组使其上下游基因表达发生了相应改变,表现为miR-29b-mimics组OIP5-AS1在mRNA水平上表达降低,而ITGB1表现为在mRNA和蛋白水平上表达降低,差异有统计学意义;miR-29b-inhibitor组表现与之相反,与阴性对照组（miR-29b-inhibitor-NC）相比,miR-29b-inhibitor 组 OIP5-AS1 表达升高,而ITGB1则表现为在mRNA和蛋白水平上表达均升高,差异有统计学意义。8.双荧光素酶检测报告结果OIP5-AS1和ITGB1的3’-UTR端均存在miR-29b的保守结合位点,OIP5-AS1可作为竞争性内源RNA（ceRNA）与ITGB1竞争性结合miR-29b。结论:1.与正常胎盘相比,重度子痫前期患者胎盘组织OIP5-AS1、miR-29b和ITGB1表达存在差异;2.OIP5-AS1可对人滋养细胞迁移和侵袭能力造成影响,且可能是通过与ITGB1竞争性结合miR-29b实现的。