【摘 要】
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猪作为流感病毒的“遗传混合容器”,目前已从世界各地猪群中分离出多种亚型的人源和禽源流感病毒,包括H1、H2、H3、H4、H5、H7和H9等。不同基因型的流感病毒同时感染猪会导致基因重配进而促进病毒的进化,从而产生具有大流行潜力的重组毒株。为了调查猪群流感病毒的流行情况,本研究于2017年7月至2018年11月期间,对广东、福建、江西、湖南猪场猪群总共采集4920份血清,并进行血凝抑制试验（HI）,
【基金项目】
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国家生猪产业技术体系资助（CARS-35）； 猪重要疫病的诊断与检测新技术研究项目（2016YFD0500707）；
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猪作为流感病毒的“遗传混合容器”,目前已从世界各地猪群中分离出多种亚型的人源和禽源流感病毒,包括H1、H2、H3、H4、H5、H7和H9等。不同基因型的流感病毒同时感染猪会导致基因重配进而促进病毒的进化,从而产生具有大流行潜力的重组毒株。为了调查猪群流感病毒的流行情况,本研究于2017年7月至2018年11月期间,对广东、福建、江西、湖南猪场猪群总共采集4920份血清,并进行血凝抑制试验（HI）,结果显示猪群广泛存在H1、H3亚型猪流感病毒的感染,总阳性率达45.55%。其中欧亚类禽猪流感H1N1病毒、H3N2 SIV、Pdm09 H1N1、经典猪流感H1N1病毒的抗体阳性率分别为31.42%、19.51%、14.39%、6.16%,EA H1N1 SIV成为猪群流感病毒感染的优势毒株,未检测到H4、H5、H6、H7亚型流感病毒抗体。猪群存在不同亚型毒株混合感染,其中EA H1N1+Pdm09 H1N1为9.25%、EA H1N1+H3N2为4.04%、Pdm09 H1N1+H3N2为2.03%。不同地区的血清抗体阳性率存在差异,福建的EA H1N1的血清抗体阳性率最高（P＜0.05）,为37.4%,河南的Pdm09 H1N1和H3N2 SIV的血清抗体阳性率最高,分别为32.42%、21.09%。猪场全年存在SIV和Pdm09 H1N1的感染,EA H1N1 SIV和H3N2 SIV在3～6月份平均血清抗体阳性率都高于全年平均抗体阳性率,pdm/09抗体阳性率也在5月份达全年高峰。不同阶段的猪群血清抗体阳性率也存在差异,其中母猪的Pdm09 H1N1血清抗体阳性率最高（P＜0.01）,公猪的EA H1N1血清抗体阳性最高（P＜0.05）,有趣的是仔猪及育肥猪的H3 SIV的血清抗体阳性高于母猪（P＜0.01）。本研究为猪场流感病毒防控和疫苗毒株的筛选提供数据参考。为了了解HA蛋白裂解位点的改变对猪流感病毒复制能力及致病性的影响,我们对比本实验室分离的毒株以及NCBI和GISAID数据库中中国地区的所有H1N1、H1N2以及H3N2亚型猪流感病毒的HA蛋白裂解位点的氨基酸序列,结果显示3种亚型的猪流感病毒HA蛋白P2位置的氨基酸分布存在多样性,H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白P2位置的氨基酸有丝氨酸（S）和丙氨酸（A）,以S为主;H1N2亚型猪流感病毒HA蛋白P2位置的氨基酸有丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和亮氨酸（L）,以S为主;H3N2亚型猪流感病毒HA蛋白P2位置的氨基酸有苏氨酸（T）和天冬酰胺（N）,以T为主。在此基础上,我们以本实验室已有的遗传距离相近的分离株A/swine/Guangdong/YJ28/2014（H1N2）（HA蛋白的P2裂解位点为L）和A/swine/Guangdong/DG2/2015（H1N2）（HA蛋白的P2裂解位点为S）互为对照,通过反向遗传技术构建野毒株r/DG2、野毒株r/YJ28及突变株r/DG2-S328L、突变株r/YJ28-L328S。病毒生长曲线结果显示r/YJ28-328L与r/YJ28-L328S突变株在MDCK和A549细胞上虽然在部分时间点上的复制能力存在差异,但都能达到相似的峰值滴度。HA蛋白裂解效率测定结果显示P2裂解位点为丝氨酸（S）的毒株,HA蛋白切割水平高于该位点为亮氨酸（L）的毒株。小鼠攻毒实验显示HA-L328S突变使得r/YJ28-L328S对小鼠的致病性相较于r/YJ28得到明显提高,与之相反的是,HA-S328L突变使得r/DG2-S328L对小鼠的致病性相较于r/DG2得到明显降低。本研究表明H1N2亚型流感病毒P2裂解位点由丝氨酸替换为亮氨酸不影响其体外培养的生长能力,但可使毒株对小鼠的致病能力减弱,这为猪流感病毒致病机制研究提供新材料,为弱毒疫苗的研发提供一种新策略。
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