论文部分内容阅读
藜麦（Chenopodium quinoa Willd）籽粒富含蛋白质、类黄酮和多酚等丰富的营养物质及生物活性成分,同时淀粉含量高达64%。现阶段,对藜麦籽粒的加工方式主要是直接将其制作为蒸煮类、发酵类、烘烤类以及其他类食品,很少有藜麦籽粒用于药物方面的加工方式。大量的文献报道,植物的种子均含有一系列的抗白色念珠菌和黑曲霉真菌等的活性蛋白,但未见关于藜麦蛋白抑制白色念珠菌的报道。由白色念珠菌（Candida albicans）引起的机体感染是全世界面临的重大公共卫生问题,其发病率和死亡率在全球范围内有逐年增加的趋势,严重威胁和危害人类健康。白色念珠菌常见于人体口腔系统、肠道系统、泌尿系统和皮肤系统,通常在人体防御能力下降或有利于其自身繁殖的条件下会引起人体疾病的发生。目前对于白色念珠菌引发的机体感染临床治疗手段主要是用唑类等药物治疗。大量药物的应用致使白色念珠菌产生了极大的耐药性,同时唑类药物损伤正常脏器,有较大的毒副作用,也给患者带来一定的伤害。因此,有必要研发绿色高效低毒的抗白色念珠菌感染的活性分子,为治疗白色念珠菌感染提供可能的候选药物。本研究以藜麦为原材料,利用磷酸盐提取液-硫酸铵盐析法从藜麦提取液中沉淀活性蛋白,利用Sephadex-G 75、Sephadex-G 50凝胶层析纯化制备具有抑制白色念珠菌的藜麦活性蛋白组分,通过一系列试验对其抑菌活性进行了探讨,并通过蛋白组学技术分析了活性蛋白的组成,同时对其作用于白色念珠菌的方式进行了研究。研究结果可以拓宽藜麦的加工领域,为开发除食品外的其它类型的应用产品甚至药物提供一定的理论指导和实践参考。形成的主要结果如下:（1）对16种藜麦材料进行筛选,ZL-07藜麦材料提取液对白色念珠菌抑制作用最佳,抑菌圈直径为（15.8±0.05）mm,因此,选择这一材料进行后续实验。在单因素试验基础上结合响应面试验,以活性蛋白提取率和对白色念珠菌的抑制作用为参考,最终确定藜麦活性蛋白的最佳提取工艺为:磷酸盐提取液p H 7.0,提取液浓度7 mmol/L,提取时间6 h,料液比1:8 g/m L。此时,抑菌圈直径可达（19.38±0.12）mm。（2）通过硫酸铵分级盐析、Sephadex G-75和Sephadex G-50凝胶层析对藜麦活性蛋白进行分离。以活性蛋白对白色念珠菌的抑制作用为参考,最终选择30%至70%饱和度的蛋白沉淀。Sephadex-G 75凝胶层析纯化最优参数为:上样浓度10 mg/m L,上样量10 m L,洗脱液流速为0.8 m L/min,用7 mmol/L磷酸盐提取液（p H 7.0,含10 m M Na Cl,1 m M EDTA）进行洗脱,藜麦粗蛋白被分为峰1、峰2两个组分,抑菌圈直径分别为峰1（无）、峰2（14.45±0.12）mm,最终选择峰2蛋白组分进一步分离;Sephadex-G 50凝胶层析纯化最优参数为:峰2组分上样浓度2 mg/m L,上样量8 m L,洗脱液流速为0.8m L/min,用7 mmol/L磷酸盐提取液（p H 7.0,含10 m M Na Cl,1 m M EDTA）进行洗脱,形成峰3、峰4和峰5三个组分,抑菌圈直径为峰3（无）、峰4（9.45±0.07）mm、峰5（11.86±0.06）mm,最终确定收集合并峰4、峰5两个组分作为藜麦抑制白色念珠菌的活性蛋白组分进行后续的研究。（3）对藜麦活性蛋白组分分别进行了温度和p H稳定性的考查,通过对白色念珠菌抑制作用可知,温度和p H对活性蛋白组分的稳定性均有显著影响。藜麦活性蛋白组分对温度表现不稳定,随着温度的升高,其对白色念珠菌的抑制作用能力逐渐减弱。在p H7.0、温度30℃时,藜麦活性蛋白组分对白色念珠菌的抑制作用最强,抑菌圈直径为（14.49±0.11）mm;藜麦活性蛋白组分对p H不稳定,且当p H＞9.0时,其对白色念珠菌无抑制作用。当p H 7.0时,藜麦活性蛋白组分对白色念珠菌抑制作用最强,抑菌圈直径为（18.43±0.08）mm。（4）不同浓度的藜麦活性蛋白组分均对白色念珠菌的生长均有抑制作用效果,并且存在一定的量效关系。光镜下,不同浓度藜麦活性蛋白组分处理组边缘褶皱均变少,边缘光滑程度增大,边缘透明度增加。电镜下,空白对照组白色念珠菌的菌体饱满,表面粗糙,出芽点突出且多,大量的白色念珠菌正在分裂生长;0.31 mg/m L藜麦活性蛋白组分处理组白色念珠菌菌体多数变皱缩,少部分菌体表面变光滑,少部分出芽点凹陷变平,菌体出芽点略微减少;0.62 mg/m L藜麦活性蛋白组分处理组白色念珠菌菌体大部分皱缩,表面光滑,出芽点大量减少,部分菌体表面破裂;0.93 mg/m L藜麦活性蛋白组分处理组白色念珠菌菌体几乎都皱缩,表面光滑,出芽点大量减少且凹陷或扁平,菌体表面裂缝明显。通过倍半稀释法确定藜麦活性蛋白组分对白色念珠菌的最低抑制浓度为182μg/m L,同时转录组测序表明,藜麦活性蛋白组分对白色念珠菌基因表达产生了影响,根据分析结果绘制了可能的作用机制图。THI13、THI4、ALS4、ZRT2、FET31和HAP3等等一系列的基因在白色念珠菌的细胞代谢、氨基酸和蛋白质合成、膜合成与降解以及金属离子的转运和稳态等方面发挥作用,进而影响白色念珠菌的正常细胞代谢活动,从而对其发挥抑制作用。