酿酒酵母生物合成苯乙醇、苯甲醇的研究

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目前,芳香族化合物苯乙醇和苯甲醇受到广泛关注。其中,苯乙醇是一种具有玫瑰香气的物质,苯甲醇作为良好的添加剂,在工业化学品生产中与其它聚合物一起生产油墨、油漆、胶水,二者在医药、香精香料和化妆品领域都有重要的应用。目前主要利用化学合成法生产苯乙醇和苯甲醇,但其具有不可持续、污染环境以及反应条件苛刻等缺点。因此,利用环境友好、底物天然易获取及低耗能的生物合成法生产苯乙醇和苯甲醇,将更加绿色、环保,且与可持续发展的理念更加契合。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种模式生物,是被世界广泛认可的安全微生物。与其他微生物相比较,酿酒酵母遗传背景清晰,具有多样的基因操作工具,可以耐受各种各样的胁迫因素,适应复杂的工业环境,且人们对其发酵过程的控制更加有经验;因此可以使用酿酒酵母作为底盘细胞,生物合成苯乙醇和苯甲醇。在本研究中,我们在酿酒酵母中分别构建了苯乙醇和苯甲醇的人工生物合成途径,通过发酵研究二者的生物合成。在苯乙醇的生产中,引入苯丙氨酸脱氨酶PAL2,阿魏酸脱羧酶FDC1,苯乙烯单加氧酶SMO及氧化苯乙烯异构酶SOI。在这条途径中,内源合成的L-苯丙氨酸在PAL2和FDC1的作用下转氨脱羧生成苯乙烯,苯乙烯进一步在SMO和SOI的作用下转化为苯乙醛,最后被内源醇脱氢酶还原得到苯乙醇。随后,使用高产L-苯丙氨酸的改造宿主菌株,通过异源苯乙烯衍生途径与内源艾氏途径双重途径共表达,摇瓶发酵可获得233 mg/L苯乙醇。此外,我们过表达了氨基酸通透酶,以提高细胞内L-苯丙氨酸的利用率,并将苯乙醇产量进一步有效提高至680 mg/L。在苯甲醇的生产中,先过表达预苯酸脱水酶PHA2,以增强内源L-苯丙氨酸的合成,进而在酿酒酵母中引入羟基扁桃酸合成酶HmaS,羟基扁桃酸氧化酶HMO,苯酰甲酸脱羧酶BFD。以内源合成的L-苯丙氨酸为起始,在HmaS的作用下转化为(S)-扁桃酸,随后在HMO和BFD的共同作用下,生成苯甲醛,最后在内源醇脱氢酶的作用下还原为苯甲醇。通过该途径,获得的苯甲醇最终浓度为4.47 mg/L。综上所述,我们的工作首次证实了苯乙烯衍生途径从头合成苯乙醇在酿酒酵母中的可行性,并通过双重途径共表达和转运工程有效提高了苯乙醇的产量;也提供了一条在酿酒酵母中从头合成苯甲醇的可行途径,为今后酿酒酵母合成苯甲醇提供参考。此外,本文构建的工程菌株可以用作高产苯乙醇、苯甲醇的酿酒酵母开发平台。
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