肺癌是目前全世界最常见的呼吸系统恶性肿瘤，近些年来其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为严重威胁人类健康的疾病之一。寻找理想的表型生物标志物，阐明肺癌发生发展过程中起关键作用的分子，以用于肺癌的早期检测诊断及预后评估一直是肺癌研究领域的热点和难点。目前临床上常用的肺癌血清标志物指标缺乏对肺癌诊断的特异性，敏感性也较低，不能实现对肺癌的早期准确诊断，从而对提高肺癌患者生存质量、延长寿命意义并不大，因此寻找提高肺癌早期诊断率的高效特异性标志物不仅具有重要临床价值，也势在必行。研究已发现，多种基因的异常表达与肺癌的发生、发展关系重大。铁蛋白轻链（Ferritin light chain，FTL）就是其中一种，它是铁蛋白的一种亚基。铁蛋白（Ferritin）是一种普遍存在于生物体内的保守性较高的多功能多亚基生物蛋白，是细胞内主要的铁储存蛋白。在体内，铁蛋白的主要生理功能是储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞，用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶。铁作为一种过渡金属元素其离子可以通过Fenton反应促进电子转移、活化氧化还原反应，并由此产生大量氧自由基（ROS），后者攻击生物大分子使其变性，使机体生物膜中不饱和脂肪酸发生过氧化而损害膜功能，从而引发广泛损伤。氧自由基还活化聚-ADP-核糖合成酶，促进核蛋白的聚-ADP-核糖化，从而使染色质折叠收缩成有丝分裂期的染色体，线粒体、内质网损伤使钙外流，导致胞浆钙离子浓度剧升，钙离子作为生物信使，可活化众多的酶，促使胞浆中各种成分亦同步进入有丝分裂状态，从而加速细胞的分裂增殖，这最终将促进癌变的发生。因此铁蛋白可以通过保护机体免受氧化损伤而在肿瘤的发生中起着重要的抑制作用。铁蛋白含有2种不同的亚基，分别为肝脏型（L型）和心脏型（H型），也称为轻链L（～19，500 Da）和重链H（～21，000Da）。铁蛋白H亚基与肿瘤之间关系的研究已有很多，已证实了它在肿瘤发生过程中起着重要的促进作用。而与之具有55％序列同源性的铁蛋白L基是否具有类似作用，这个问题也开始引起一些研究人员的重视。目前，在对多种肿瘤的研究中都发现有FTL亚基的异常表达，如肝癌、胃癌等。本课题组前期运用比较蛋白质组学技术也发现FTL基因在肺癌组织中存在异常表达，提示该蛋白可能在肺癌的发生发展中起着重要作用。本研究运用RT-PCR技术从人肺癌组织中获取人FTL基因的cDNA序列，将其扩增产物FTL基因插入到原核表达载体pET-30a（+）中，转化入大肠杆菌JM109中，通过电泳条带比对、PCR扩增、单双酶切分析及序列测定等方法对重组质粒pET30a（+）-FTL进行鉴定，将测序正确的含有目的基因的重组子转化到大肠杆菌BL21中，鉴定后，用IPTG对重组子pET30a（+）-FTL进行诱导表达，优化表达条件，使之高效表达融合蛋白，表达产物用镍树脂亲和层析法纯化。通过将纯化产物免疫日本大耳白兔，获得抗FTL的多克隆抗体，为开展FTL分子后续功能的研究及寻找到肺癌特异性抗原提供了重要前提。本研究旨在建立体外高效表达FTL的方法，获得纯度较高的FTL蛋白，免疫动物后获得其多克隆抗体，为进一步研究其在肺癌发生、发展中的生物学功能奠定基础。实验方法：1．总RNA的制备及RT-PCR方法扩增FTL基因用Trizol一步法提取RNA，用AMV以随机引物把RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，用FTL基因的上下游特异性引物和DNA Taq plus polymerase进行PCR扩增，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。通过RT半定量方法分析FTL mRNA在肺癌组织中的表达情况，并与自身癌周组织进行比较。2．目的基因与表达载体的连接、转化及重组子的鉴定将扩增的FTL基因与表达载体pET-30a（+）按照合适的比例混合，加入T4 DNA连接酶，在16℃恒温连接仪中连接过夜，将上述连接产物转化大肠杆菌JM109，阳性克隆通过观察转化平板上菌落生长状况初步判定。挑取可疑菌落培养，小提质粒后通过单、双酶切（EcoRⅠ、XhoⅠ）、特异PCR扩增及测序进一步鉴定。目的基因的序列测定由北京三博远志生物技术公司完成，通过BLAST分析软件将测序结果与GeneBank中公布的已知序列进行分析和比较。3．重组质粒转化BL21及鉴定将测序正确的含有目的基因的重组子转化到大肠杆菌BL21中，对转化结果进行鉴定，方法同上。4．FTL融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化将鉴定正确的重组质粒经不同浓度的IPTG诱导，收集不同诱导时间的菌液，变性处理后，进行SDS-PAGE，用蛋白Marker参比，比较不同诱导条件下FTL融合蛋白的表达情况，寻找最佳诱导条件。大量诱导后的菌体经超声破碎后进行离心，分离上清和沉淀，通过SDS-PAGE比较诱导蛋白产物在上清和沉淀中的表达量，确定FTL融合蛋白的主要表达形式。上清液及处理后的包涵体溶液经镍树脂亲和层析法进行纯化。5．抗FTL多克隆抗体的制备将纯化后的FTL融合蛋白配制成1mg／ml的浓度，取出1ml与等体积弗氏佐剂充分混合，背部多点皮下注射日本大耳白兔，隔2周加强免疫一次，加强时剂量减半，共加强2次。于下次免疫的前1周采取少量血，用免疫双向扩散方法测定抗体效价，当效价达到1:64时停止免疫，采血并分离血清。以采集的免疫血清为一抗（1:64），羊抗兔IgG-HRP为二抗（1:600），与提取的人肺鳞癌、肺腺癌组织总蛋白及诱导表达的全菌蛋白进行Western blot分析。结果与分析：1．总RNA的提取和FTL基因的扩增从人肺癌组织中提取总RNA的电泳结果显示提取的总RNA呈现28S，18S，5S 3条带，说明提取的RNA条带完整。紫外分光光度计测定结果：A₂₆₀／A₂₈₀＞1.8，表明提取的总RNA纯度符合反转录要求。将RNA逆转录为cDNA,以后者为模板扩增FTL基因，1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示：扩增出单一特异性条带，大小位于500～600bp，靠近500bp处，与预期528bp位置一致，表明可能已扩增出人FTL基因。半定量分析结果显示，FTLmRNA在肺癌组织中的表达水平高于对照组织，差异有统计学意义（P=-0.001）。而在肺鳞癌和肺腺癌2组中FTL mRNA表达水平之间的差异无统计学意义（P=0.656）。2．pET30a（+）-FTL重组质粒的构建与鉴定将FTL的PCR扩增产物与表达载体pET-30a（+）分别经双酶切（EcoRⅠ、XhoⅠ）后回收、连接、转化JM109，涂板培养12～16h，可观察到连接产物转化板上有10多个均匀分布的单菌落生长，其数目显著少于阳性对照板，而阴性对照板则无菌落生长。挑取单菌落振荡培养后提取质粒，进行鉴定。结果EcoRⅠ单酶切片段长度为5.95kb左右，EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切产物分别是5.42kb和0.528kb，与预期结果一致。以阳性质粒为模板，用FTL基因的上下游引物进行特异PCR扩增，获得大小为528bp的片断，证明pET30a（+）-FTL重组质粒构建成功。将测序结果输入Genebank，经BLAST软件分析，与人FTL基因（GI：NM₀00146.3）的cDNA序列进行比较，同源性达到99％。3．重组质粒pET30a（+）-FTL转化BL21菌株及鉴定将测序正确的重组质粒转化BL21菌株，涂板培养后，挑取单菌落进行鉴定，结果同上，证明已将pET30a（+）-FTL成功转入BL21菌株中。4．BL21（pET30a（+）-FTL）的表达、可溶性分析及蛋白纯化将重组质粒经不同浓度的化学诱导剂IPTG诱导不同时间，SDS-PAGE观察各不同诱导条件下目的蛋白的表达情况，结果显示当以不同浓度IPTG诱导时，在25.1KDa处均有目的蛋白条带，与预期的带有6个组氨酸标签的FTL融合蛋白的分子量相符合。IPTG终浓度在0.01～0.3mmol／L时，诱导效果大致相同，其中当IPTG终浓度在0.03mmol／L时蛋白诱导量最大，不同时间蛋白诱导表达的结果显示诱导5h时的蛋白表达量最高。经Genetools软件分析，目的蛋白带含量占全菌蛋白的38％左右。大量诱导的产物经超声破碎并离心，分离上清和沉淀后进行的SDS-PAGE结果显示，融合蛋白在上清和沉淀中均有表达，其中在沉淀中的表达量显著高于上清，经Genetools软件分析，结果表明其在沉淀中的含量约是上清中表达量的9.6倍。将上清和经变性处理后的沉淀溶解液进行镍树脂亲和层析纯化，结果得到较纯的融合蛋白，相对含量达85.47％。5．抗FTL多克隆抗体的制备测定纯化后的融合蛋白含量，配制成合适浓度与弗氏佐剂混合后免疫动物，加强免疫2次后，采血并分离血清。琼脂凝胶双向扩散平板上免疫血清与抗原孔之间出现白色沉淀线，而对照未出现，证明获得了抗FTL的多克隆抗体，效价达到1：64。免疫血清与提取的人肺鳞癌、肺腺癌组织总蛋白及诱导表达的全菌蛋白的Western blot分析结果表明，3种蛋白均能与免疫血清反应，与人肺鳞癌、肺腺癌组织总蛋白的反应条带在大约19.5KDa处，即组织中FTL天然蛋白的位置；而与全菌蛋白的反应条带在大约25.1KDa处，与FTL融合蛋白的位置相符合。结论：1．成功克隆了FTL基因的全基因编码序列，FTL mRNA在肺癌组织中的表达水平高于相应癌旁组织。2．采用pET-30a（+）原核表达系统实现了FTL在原核细胞中的高效表达。3．用镍树脂亲和层析法纯化出了带有His标签的FTL蛋白，为后续的抗体制备及诊断抗原的研制提供了重要前提。4．制备的抗FTL多克隆抗体具有较高的特异性，效价达1：64，可以作为检测抗体用于后续研究中判断FTL是否具有肺癌特异性及肿瘤特异性。