背景多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种恶性克隆性浆细胞增殖性疾病,中老年人为主,临床表现多样,其约占血液系统恶性肿瘤的10%,是血液系统第二常见的恶性肿瘤。随着近年来对于该疾病研究的深入,其检测、诊治办法的不断完善,MM患者的预后得到了一定程度的改善。但患者肿瘤复发率仍然较高,难以治愈,目前仍是治疗的难点。因此,进一步加深关于MM发生、发展的机制研究具有重要意义。其中,肿瘤血管生成是促进骨髓瘤细胞生存、增殖及迁移的重要因素之一,并且与患者的预后密切相关。骨髓微环境是支持和调节造血细胞定居、增生、分化、发育和成熟的内环境。主要由基质细胞、细胞外基质、造血调控因子及血管神经组成,其在MM瘤细胞的生存、增殖、迁移、耐药等方面具有重要作用。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是MM骨髓微环境中最重要的免疫细胞,其来源于血液中单核细胞。TAMs的浸润与MM血管生成等密切相关。巨噬细胞（macrophages,MΦs）在骨髓微环境不同细胞因子的刺激下发生极化并根据表型分为M1和M2型,M1型TAMs主要发挥抗肿瘤作用,具有抑制肿瘤血管生成的作用,而M2型TAMs则主要促进肿瘤的发生、发展,并促进肿瘤血管生成,MM骨髓微环境中的TAMs主要为M2型。外泌体（exosomes）是一类由细胞膜和多囊泡体（multivesicular bodies,MVB）内吞所形成的具有磷脂双层膜结构的囊泡小体,直径介于30～150nm之间,可携带多种mRNA、蛋白质及miRNA等。研究表明外泌体可通过多种途径将其内容物运送至靶细胞,进而调控靶细胞的功能。外泌体不但通过抗原呈递、免疫抑制、信号分子转运等途径参与炎症反应,而且与肿瘤生长、转移及血管生成密切相关。除此之外,外泌体还参与了 TAMs的极化。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类参与转录后基因调控机制的内源性非编码单链RNA,长度约为20-24个核苷酸。研究表明,肿瘤细胞源性外泌体具有合成miRNA的能力,而且不需要依赖其起源细胞,不同肿瘤细胞分泌的外泌体中包含特殊的miRNA,这些miRNA具有诱导肿瘤细胞增殖,细胞外基质重塑,促进迁移、侵袭和肿瘤血管生成等功能。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）作为重要的肿瘤微环境中的基质细胞,其通过释放外泌体中的miRNA可以与白血病细胞进行细胞-细胞间通讯,进而参与调控白血病细胞的增殖、凋亡、迁移以及耐药。其中,miR-let-7c在BMMSCs分泌的外泌体中呈现高表达。而MM骨髓微环境中miR-let-7c对于血管生成调控机制的研究较少,探讨MM中miR-let-7c对于血管生成的影响可为进一步深入研究MM的发生发展提供新的研究思路。目前,关于BMMSCs释放的外泌体在MM中作用的研究报道很少,我们通过前期的研究及文献分析发现,骨髓瘤患者BMMSCs源性外泌体中的miR-let-7c在调节MM肿瘤微环境中血管生成具有重要作用,并提出“骨髓瘤患者BMMSCs源性外泌体中的miR-let-7c可能一方面通过促进MΦs极化为M2型TAMs来增强MM的血管生成,另一方面通过缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）/Let-7/argonaute1（AGO1）/VEGF 信号通路参与了缺氧所诱导的血管生成”的假想。故我们以BMMSCs源性外泌体中高表达的miR-let-7c为切入点,研究BMMSCs源性外泌体中miR-let-7c引起MΦs极化及其极化后对MM血管生成的影响与其机制;研究外泌体中miR-let-7c在缺氧诱导的信号通路中对MM血管生成的影响;并探讨在体内外抑制及过表达miR-let-7c水平对MΦs极化及MM血管生成的影响及其机制。为进一步探讨阻断MM血管生成的新途径提供理论依据。方法1.BMMSCs的分离和鉴定:无菌条件下收集MM患者骨髓穿刺组织标本,通过密度梯度离心法得到单个核细胞,直接接种于含α-MEM培养基的六孔板中进行常规细胞培养,经2-4次传代培养后,采用流式细胞仪检测BMMSCs相关表面标记STRO-1、CD105及CD90,对所培养的细胞进行鉴定。2.BMMSCs源性外泌体的提取与鉴定:采用超高速离心法及ExoQuick-TC试剂盒法两种方法提取外泌体,透射电子显微镜观察BMMSCs源性外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析仪分析其粒径和浓度,运用流式细胞仪方法检测其特有的表面标志物CD63、CD81的表达,对BMMSCs源性外泌体进行鉴定。3.探讨BMMSCs源性外泌体对MΦs极化的影响:采用密度梯度离心法从正常志愿者外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,通过CD14磁珠阳性分选法得到PBMCs中的MΦs,将细胞分为BMMSCs+MΦs共培养组,外泌体+MΦs共培养组以及MΦs单独培养的空白对照组。应用流式细胞仪检测各组细胞M2型TAMs表面标志物CD206的表达情况;采用qRT-PCR检测各组MΦs中miR-let-7c的表达情况。按PKH26染液的操作规范,将PKH26荧光标记的外泌体与结合CD68-FITC的MΦs共培养,经DAPI染色后在共聚焦显微镜观察外泌体被MΦs摄取的情况。4.探讨调控MΦs内miR-let-7c的表达对其极化的影响:采用LV3-miR-let-7c模拟物（mimics）和LV3-miR-let-7c抑制物（inhibitor）慢病毒载体分别感染MΦs并构建miR-let-7c过表达及抑制的稳定细胞株,同时设置LV3-NC为空白对照组,采用qRT-PCR验证各组MΦs中miR-let-7c的过表达及抑制水平,通过流式细胞仪检测各组M2型TAMs表面标志物CD206的水平变化。5.骨髓瘤血管内皮细胞（myeloma vascular endothelial cells,MVECs）的分离和鉴定:通过密度梯度离心法从MM患者的骨髓穿刺液中得到单个核细胞,经贴壁换液法提取内皮祖细胞,并在含有VEGF、hFGF等生长因子的EGM-2培养基诱导下分离得到MVECs。经2-4代传代培养后,收集MVECs并采用免疫细胞化学法检测血管内皮标志物CD31、CD34对MVECs进行鉴定。6.探讨极化后的M2型TAMs对MVECs的影响:将细胞分组培养:MVECs+M2型TAMs共培养组,MVECs+MΦs共培养组,以及MVECs单独培养组（空白对照组）,运用CCK-8试剂盒检测各组MVECs的增殖能力;采用划痕实验及Transwell迁移实验观察各组MVECs的迁移能力;采用小管形成实验观察各组MVECs的体外成环能力;采用qRT-PCR技术检测各组MVECs中miR-let-7c 的表达。7.探讨BMMSCs源性外泌体在体内对MΦs极化和血管生成的影响及其可能机制:分别构建保留体内MΦs的小鼠MM移植瘤模型和清除体内MΦs的小鼠MM移植瘤模型,实验组瘤体注射BMMSCs来源的外泌体,对照组注射同剂量磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）。实验结束后瘤体称重、测量其体积并拍照。采用qRT-PCR检测各组移植瘤组织中miR-let-7c的表达,采用免疫组织化学方法,以CD31标记血管内皮细胞,计算各组移植瘤组织微血管密度（microvessel density,MVD）值;分别以CD16、CD163标记各组移植瘤组织中M1型及M2型TAMs;采用免疫组织化学、Western blot方法检测各组移植瘤组织中HIF-1α、AGO1及VEGF的蛋白表达;采用原位杂交、qRT-PCR法检测各组移植瘤组织中HIF-1α AGO1及VEGF的mRNA表达。8.探讨调控miR-let-7c表达对MVECs生物学功能的影响及其可能机制:通过 LV3-miR-let-7c mimics、LV3-miR-let-7c inhibitor 的慢病毒载体分组感染MVECs,并设立NC对照组;采用qRT-PCR技术验证各组MVECs中miR-let-7c的表达水平,运用CCK-8试剂盒检测各组MVECs的增殖能力,采用划痕实验及Transwell迁移实验观察各组MVECs的迁移能力,采用小管形成实验观察各组MVECs的体外成环能力。收集各组MVECs,并采用Western blot技术检测各组细胞中HIF-1α、AGO1及VEGF的蛋白表达;采用qRT-PCR技术检测各组细胞中HIF-1α、AGO1及VEGF的mRNA水平。9.探讨miR-let-7c与AGO1的靶向调控作用:采用生物信息学软件miRDB和Targetscan预测筛选miR-let-7c对AGO1的靶向调控区。合成AGO1野生型（AGO1 3’UTR-WT）、AGO1 突变型（AGO1 3’UTR-MUT）以及对照质粒并分别转染LV3-miR-let-7c mimics及LV3-NC组细胞,采用双荧光素酶报告系统验证miR-let-7c对AGO1的靶向调控作用。10.探讨miR-let-7c mimics及inhibitor体内对MΦs极化及MM血管生成的影响及其可能机制:构建小鼠MM模型:将miR-let-7c mimics、inhibitor及NC慢病毒感染的稳定细胞株分别注入小鼠腋背部皮下,实验结束后瘤体称重、测量其体积并拍照,采用qRT-PCR检测各组移植瘤组织中miR-let-7c的表达,采用免疫组织化学方法,以CD31标记血管内皮细胞,计算各组移植瘤组织MVD值;分别以CD16、CD163标记各组移植瘤组织中M1型及M2型TAMs;采用免疫组织化学检测各组移植瘤组织中HIF-1α、AGO1及VEGF的蛋白表达;采用qRT-PCR方法检测各组移植瘤组织中HIF-1α、AGO1及VEGF的mRNA水平。11.数据的统计学处理:采用Graphad Prim 6.0软件进行数据分析,所有计量资料均采用均数±标准差表示,两组均数间用独立样本t检验（t-test）,两组以上均数的比较采用方差分析（ANOVA）,以α=0.05作为检验水准。结果1.成功分离并原代培养BMMSCs,其形态学及表面标志物STRO-1、CD105 及 CD90 表达（分别为 99.4%、96.2%及 98.8%）均符合 BMMSCs 特征。2.提取的外泌体呈典型的双层膜茶托样结构,其粒径中20-200 nm范围占71.5%,CD63和CD81表面蛋白均呈阳性表达（分别为81.1%和91.7%）,符合外泌体特征。3.流式细胞仪结果显示,外泌体共培养组M2型TAMs特异性标志物CD206的水平明显升高（p＜0.01）。qRT-PCR结果显示:与外泌体共培养后细胞内miR-let-7c的水平明显上调（p＜0.01）。在共聚焦显微镜下可见PKH26标记的外泌体向DAPI染色的MΦs胞浆内聚集。4.成功构建miR-let-7c过表达及抑制的稳定细胞株。流式细胞术结果显示,过表达组M2型TAMs 比例较对照组明显增加（p＜0.05）而抑制组M2型TAMs 比例则减少（p＜0.01）。5.成功分离并原代培养MVECs,免疫细胞化学结果验证,内皮细胞表面标志物CD31、CD34的表达均为强阳性,符合MVECs特征。6.运用CCK-8试剂盒检测结果显示,MVECs与M2型TAMs共培养72 h后,细胞增殖能力出现明显增强（p＜0.05）。通过划痕实验和Transwell迁移实验证实,MVECs在与M2型TAMs共培养72 h后细胞迁移能力明显增强（p＜0.01）,小管形成实验结果显示,MVECs在与M2型TAMs共培养72 h后细胞体外成管能力明显增强（p＜0.01）。7.在保留MΦs和清除MΦs的小鼠MM移植瘤模型中,与对照组相比,外泌体组移植瘤体积和重量均明显增加（均p＜0.05）。经免疫组化检测移植瘤内CD16和CD163表达可见,外泌体组中M2型TAMs浸润较对照组明显增加（p＜0.01）,M1型TAMs浸润减少并不明显（p=0.0698）。qRT-PCR结果显示,外泌体组移植瘤中miR-let-7c水平与对照组相比明显升高,以保留MΦs组为著（p＜0.01）,通过免疫组化标记CD31结果显示:外泌体组MVD值明显上升,尤其是在MΦs参与下（p＜0.01）,提示外泌体中miR-let-7c促进了 MM移植瘤血管生成,且M＜Φs在MM中对其血管生成主要起促进作用;与对照组相比,外泌体注射后骨髓瘤移植瘤HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白水平明显增加（均p＜0.05）,而AGO1的mRNA及蛋白水平降低（均p＜0.01）。8.经嘌呤霉素筛选并通过qRT-PCR鉴定了 LV3-miR-let-7c mimics,inhibitor及NC感染的MVECs稳染株,发现过表达miR-let-7c后,骨髓瘤血管内皮细胞的细胞增殖能力、迁移能力及成管能力明显增加（均p＜0.01）,相反,抑制miR-let-7c表达后,血管内皮细胞的增殖能力、迁移能力及成管能力较对照组减弱（均p＜0.01）。9.生物信息学软件miRDB和Targetscan预测出miR-let-7c与AGO1存在与3’UTR结合的靶向调控区。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与LV3-NC+AGO1 WT组相比,miR-let-7c mimics+AGO1 WT组细胞中荧光素酶活性明显降低,差异具有统计学意义（p＜0.05）。证明miR-let-7c可以通过靶向AGO1抑制其表达。10.在小鼠MM移植瘤模型中,miR-let-7c mimics组移植瘤体积和重量明显增加（p＜0.05）;而miR-let-7c inhibitor组移植瘤生长明显受抑制,其体积和重量明显降低（p＜0.01）。且上调miR-let-7c水平后,小鼠移植瘤内M2型TAMs浸润明显增多（p＜0.001）,M1型TAMs明显减少（p＜0.01）,相应地MVD值出现明显上升（p＜0.05）,血管生成增加;抑制miR-let-7c表达后,小鼠移植瘤内M2型TAMs浸润明显减少（p＜0.01）,M1型TAMs无明显增多,可见MVD值明显下降（p＜0.05）。与对照组相比,miR-let-7c mimics组HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白水平明显增加（p＜0.05）,而AGO1的mRNA及蛋白水平降低（p＜0.05）。相反,在miR-let-7c inhibitor组移植瘤中HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白水平明显降低（p＜0.05）,而AGO1的mRNA及蛋白水平升高（p＜0.05）。结论1.BMMSCs释放的外泌体中miR-let-7c可以在体内外诱导MΦs极化为M2型TAMs,从而促进MM血管生成。2.miR-let-7c可以在体内外通过HIF-1α/Let-7/AGO1/VEGF信号通路参与调控MM血管生成。3.外泌体中的miR-let-7c具有成为MM理想治疗靶点的潜力。