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【目的】
1.研究不同浓度脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)对动力学相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)介导线粒体自噬与肺上皮细胞坏死性凋亡的影响。
2.研究Drp1抑制剂对LPS诱导急性肺损伤中肺上皮细胞坏死性凋亡的影响。
3.探讨Drp1介导线粒体自噬与坏死性凋亡在LPS诱导急性肺损伤中的机制。
【方法】
1.研究不同浓度LPS对Drp1介导线粒体自噬和肺上皮细胞坏死性凋亡的影响
对数生长期A549细胞随机分为：对照组、5μg/mLLPS组、10μg/mLLPS组、25μg/mLLPS组、50μg/mLLPS组。对照组细胞给予100uLPBS培养16h；其余组分别采用等体积PBS稀释的5、10、25、50μg/mLLPS处理16h。采用Westernblot法检测各组细胞坏死性凋亡标志蛋白受体相互作用蛋白激酶3磷酸化(Phosphorylation-receptor interacting protein kinase 3，p-RIP3)水平、受体相互作用蛋白激酶1(Phosphorylationreceptor interacting protein kinase 1，RIPK1)、混合谱系激酶结构域样蛋白磷酸化(Phosphorylation-mixed lineage kinase domain-like protein，p-MLKL)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α以及线粒体自噬标志蛋白PTEN诱导的推定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)、自噬相关微观蛋白轻链(Autophagy microtubule-associated protein light chain alpha 3，LC3B)、Drp1、线粒体融合蛋白2磷酸化(Mitofusin2，p-Mfn2)相对表达量，并采用JC-1线粒体探针检测线粒体膜电位。
2.Drp1介导线粒体自噬在LPS诱导的肺损伤中的作用
细胞实验:对数生长期A549细胞分为对照组、Mdivi-1组(Mitochondrialdivisioninhibitor1，Drp1抑制剂)、LPS组、LPS+Mdivi-1组。对照组加入100uLPBS，Mdivi-1组加入终浓度为10μmol/L的mdivi-1，LPS组加入终浓度50μg/mLLPS，LPS+Mdivi-1组先予终浓度为10μmol/L的mdivi-1预处理1小时后，加入终浓度50μg/mLLPS培养16小时。
动物实验：根据随机数字表，将6-8周龄，体重(21±3)g的雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、Mdivi-1组、LPS组、LPS+Mdivi-1组，每组6只。对照组：小鼠经鼻滴入PBS40μL。Mdivi-1组：采用mdivi-13mg/kg溶于100μL经小鼠尾静脉注射3小时后再经鼻滴入40μLPBS。LPS组：先经尾静脉注射PBS100μL(含0.1%体积的DMSO)预处理3小时，再以LPS10mg/kg溶于40μL经鼻滴入。LPS+Mdivi-1组：3mg/kgmdivi-1溶于100μLPBS经尾静脉注射预处理3小时，然后LPS10mg/kg溶于40μL经鼻滴入，继续饲养24h后处理小鼠，取肺组织进一步观察。
采用Westernblot法检测各组细胞坏死性凋亡标志蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL与线粒体自噬标志蛋白PINK1、LC3B、Drp1、p-Mfn2相对表达量。水合氯醛麻醉小鼠，眼球采血，血液室温静置30min后，1300rpm/min，离心10min，酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，Elisa)检测小鼠血清炎症因子TNF-α，C型反应性蛋白(C reactive protein，CRP)，白细胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)表达水平。小鼠经头颈脱臼处死，剖胸取出肺组织，H＆E检测肺组织病理变化，评估肺损伤，免疫组化检测肺组织p-RIP3、RIPK1、p-MLKL表达。
【结果】
1.不同浓度梯度的LPS(5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL)干预A549细胞16小时后，坏死性凋亡标志蛋白p-RIP3、RIPK1和p-MLKL与自噬相关蛋白LC3B的蛋白表达呈现浓度依赖性增加；p-Mfn2与线粒体内膜标志蛋白COXIV表达依次下调，膜电位下降，呈现浓度依赖性，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组比较，5μg/mLLPS组细胞Drp1蛋白相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05)，而10、25、50μg/mLLPS组细胞Drp1表达量蛋白依次增高，并存在浓度依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.与对照组比较，LPS组坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL与Drp1蛋白表达上调，COXIV与p-Mfn2蛋白表达下调，细胞存活率下降；与LPS组比较，LPS+Mdivi-1组坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL蛋白与Drp1蛋白表达明显下调，COXIV与p-Mfn2蛋白表达增加，细胞活率提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.LPS介导的急性肺损伤模型：与对照比较，LPS组显示出炎性细胞浸润增多，肺泡结构破坏严重，LPS组肺损伤评分增加，肺组织的坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL表达增加，肺组织的湿干重工比值(Wet/Dry)升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；此外，血浆中TNF-α、CRP与IL-1β表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。而与LPS组比较，LPS+Mdivi-1组坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL表达降低，肺损伤减轻，血浆炎症因子表达下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
【结论】
1.Drp1介导线粒体自噬调控LPS诱导肺上皮细胞发生坏死性凋亡。
2.抑制Drp1可减少肺上皮细胞坏死性凋亡，同时还可以降低急性肺损伤模型小鼠的炎症反应进一步改善急性肺损伤。
1.研究不同浓度脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)对动力学相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)介导线粒体自噬与肺上皮细胞坏死性凋亡的影响。
2.研究Drp1抑制剂对LPS诱导急性肺损伤中肺上皮细胞坏死性凋亡的影响。
3.探讨Drp1介导线粒体自噬与坏死性凋亡在LPS诱导急性肺损伤中的机制。
【方法】
1.研究不同浓度LPS对Drp1介导线粒体自噬和肺上皮细胞坏死性凋亡的影响
对数生长期A549细胞随机分为：对照组、5μg/mLLPS组、10μg/mLLPS组、25μg/mLLPS组、50μg/mLLPS组。对照组细胞给予100uLPBS培养16h；其余组分别采用等体积PBS稀释的5、10、25、50μg/mLLPS处理16h。采用Westernblot法检测各组细胞坏死性凋亡标志蛋白受体相互作用蛋白激酶3磷酸化(Phosphorylation-receptor interacting protein kinase 3，p-RIP3)水平、受体相互作用蛋白激酶1(Phosphorylationreceptor interacting protein kinase 1，RIPK1)、混合谱系激酶结构域样蛋白磷酸化(Phosphorylation-mixed lineage kinase domain-like protein，p-MLKL)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α以及线粒体自噬标志蛋白PTEN诱导的推定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)、自噬相关微观蛋白轻链(Autophagy microtubule-associated protein light chain alpha 3，LC3B)、Drp1、线粒体融合蛋白2磷酸化(Mitofusin2，p-Mfn2)相对表达量，并采用JC-1线粒体探针检测线粒体膜电位。
2.Drp1介导线粒体自噬在LPS诱导的肺损伤中的作用
细胞实验:对数生长期A549细胞分为对照组、Mdivi-1组(Mitochondrialdivisioninhibitor1，Drp1抑制剂)、LPS组、LPS+Mdivi-1组。对照组加入100uLPBS，Mdivi-1组加入终浓度为10μmol/L的mdivi-1，LPS组加入终浓度50μg/mLLPS，LPS+Mdivi-1组先予终浓度为10μmol/L的mdivi-1预处理1小时后，加入终浓度50μg/mLLPS培养16小时。
动物实验：根据随机数字表，将6-8周龄，体重(21±3)g的雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、Mdivi-1组、LPS组、LPS+Mdivi-1组，每组6只。对照组：小鼠经鼻滴入PBS40μL。Mdivi-1组：采用mdivi-13mg/kg溶于100μL经小鼠尾静脉注射3小时后再经鼻滴入40μLPBS。LPS组：先经尾静脉注射PBS100μL(含0.1%体积的DMSO)预处理3小时，再以LPS10mg/kg溶于40μL经鼻滴入。LPS+Mdivi-1组：3mg/kgmdivi-1溶于100μLPBS经尾静脉注射预处理3小时，然后LPS10mg/kg溶于40μL经鼻滴入，继续饲养24h后处理小鼠，取肺组织进一步观察。
采用Westernblot法检测各组细胞坏死性凋亡标志蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL与线粒体自噬标志蛋白PINK1、LC3B、Drp1、p-Mfn2相对表达量。水合氯醛麻醉小鼠，眼球采血，血液室温静置30min后，1300rpm/min，离心10min，酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，Elisa)检测小鼠血清炎症因子TNF-α，C型反应性蛋白(C reactive protein，CRP)，白细胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)表达水平。小鼠经头颈脱臼处死，剖胸取出肺组织，H＆E检测肺组织病理变化，评估肺损伤，免疫组化检测肺组织p-RIP3、RIPK1、p-MLKL表达。
【结果】
1.不同浓度梯度的LPS(5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL)干预A549细胞16小时后，坏死性凋亡标志蛋白p-RIP3、RIPK1和p-MLKL与自噬相关蛋白LC3B的蛋白表达呈现浓度依赖性增加；p-Mfn2与线粒体内膜标志蛋白COXIV表达依次下调，膜电位下降，呈现浓度依赖性，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组比较，5μg/mLLPS组细胞Drp1蛋白相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05)，而10、25、50μg/mLLPS组细胞Drp1表达量蛋白依次增高，并存在浓度依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.与对照组比较，LPS组坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL与Drp1蛋白表达上调，COXIV与p-Mfn2蛋白表达下调，细胞存活率下降；与LPS组比较，LPS+Mdivi-1组坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL蛋白与Drp1蛋白表达明显下调，COXIV与p-Mfn2蛋白表达增加，细胞活率提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.LPS介导的急性肺损伤模型：与对照比较，LPS组显示出炎性细胞浸润增多，肺泡结构破坏严重，LPS组肺损伤评分增加，肺组织的坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL表达增加，肺组织的湿干重工比值(Wet/Dry)升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；此外，血浆中TNF-α、CRP与IL-1β表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。而与LPS组比较，LPS+Mdivi-1组坏死性凋亡蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL表达降低，肺损伤减轻，血浆炎症因子表达下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
【结论】
1.Drp1介导线粒体自噬调控LPS诱导肺上皮细胞发生坏死性凋亡。
2.抑制Drp1可减少肺上皮细胞坏死性凋亡，同时还可以降低急性肺损伤模型小鼠的炎症反应进一步改善急性肺损伤。