【摘 要】
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目的:从E3连接酶RNF183诱导IκBα泛素化修饰调节NF-κB信号通路角度,研究艾灸调控NLRP3蛋白表达及其治疗UC的作用机制,为阐明艾灸治疗UC的作用机制提供科学研究资料。方法:1.将清洁级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、艾条灸组和西药组。采用自由饮用3.5%（w/v）DSS制备大鼠UC模型。艾条灸组取天枢穴（双侧）,给予温和灸治疗;西药组给予美沙拉嗪溶液灌胃治疗。正常组和模型组不进行
【基金项目】
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上海市自然科学基金项目（NO.19ZR1451600）“基于RNF183连接酶研究艾灸调控NLRP3泛素修饰治疗溃疡性结肠炎的作用机制”； 上海中医药大学预算内项目（NO.18LK050）,“艾灸对结肠巨噬细胞NLRP3炎症小体泛素修饰的调节及其治疗溃疡性结肠炎的作用机制研究”；
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目的:从E3连接酶RNF183诱导IκBα泛素化修饰调节NF-κB信号通路角度,研究艾灸调控NLRP3蛋白表达及其治疗UC的作用机制,为阐明艾灸治疗UC的作用机制提供科学研究资料。方法:1.将清洁级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、艾条灸组和西药组。采用自由饮用3.5%（w/v）DSS制备大鼠UC模型。艾条灸组取天枢穴（双侧）,给予温和灸治疗;西药组给予美沙拉嗪溶液灌胃治疗。正常组和模型组不进行任何治疗,只做与艾条灸组相同的抓取和固定。治疗结束后,检测各组大鼠DAI、CMDI;采用HE染色,光镜下观察结肠组织病理损伤并评分;运用IHC检测结肠IL-1β、NLRP3蛋白表达;采用正检测结肠Ub蛋白表达。2.将清洁级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、艾条灸组和对照组。艾条灸组取天枢穴（双侧）,给予温和灸治疗;对照组给予泛素化抑制剂MG132腹腔注射干预。治疗结束后,检测各组大鼠的DAI、CMDI及组织病理学损伤评分;采用HE染色,光镜下观察结肠组织病理损伤并评分;运用IHC检测结肠IL-1β、NLRP3蛋白表达;采用WB分别检测结肠RNF183、IκBα和NF-κB p65蛋白表达;采用IF分别观察结肠IκBα/Ub以及IκBα/RNF183蛋白的共表达;采用Co-IP技术,观察IκBα与RNF183蛋白的相互作用。结果:1.艾灸对UC大鼠结肠炎症及NLRP3、Ub蛋白表达的影响与正常组比较,模型组大鼠DAI、CMDI及组织病理学损伤评分均显著升高（均P＜0.01）,HE染色显示结肠组织损伤明显,存在不同程度的水肿、炎症及溃疡等,结肠组织NLRP3、IL-1β及Ub蛋白的表达均显著增强（P＜0.01,P＜0.05）。与模型组比较,艾条灸组和西药组大鼠DAI、CMDI及组织病理学损伤评分均显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,NLRP3、IL-1β及 Ub 蛋白的表达均减少（P＜0.01,P＜0.05）。与艾条灸组比较,西药组大鼠结肠组织病理学评分显著升高（P＜0.01）,DAI、CMDI评分及NLRP3、IL-1β与Ub蛋白的表达差异均不显著（均P＞0.05）。相关性分析显示,结肠组织Ub蛋白的表达与NLRP3蛋白的表达之间及与结肠组织病理学损伤评分之间存在中度或强度正相关性（r=0.536,P＜0.01;r=0.677,P＜0.01）,NLRP3蛋白的表达与病理学评分之间存在中度正相关性（r=0.470,P＜0.01）。2.基于RNF183诱导IκBα泛素化修饰研究艾灸调节UC大鼠结肠NLRP3的作用机制与正常组比较,模型组大鼠DAI、CMDI及结肠组织病理学损伤评分均升高,并且结肠损伤严重（均P＜0.01）,以连续性溃疡和大量炎性细胞浸润为主要表现;结肠组织Ub和RNF183蛋白表达均明显增加（均P＜0.01）,IκBα蛋白表达减少（P＜0.01）,NF-κB p65、NLRP3 和 IL-1β蛋白表达均增加（P＜0.01,P＜0.05）。与模型组比较,艾条灸组和对照组大鼠结肠损伤有所修复,炎症反应减轻,DAI、CMDI及结肠组织病理学损伤评分均显著降低（均P＜0.01）,结肠Ub和RNF183蛋白表达均明显减少（均P＜0.01）,IκBα蛋白表达增加（P＜0.01）,NF-κB p65、NLRP3和IL-1β蛋白表达均显著降低（P＜0.01,P＜0.05）。与艾条灸组比较,对照组大鼠DAI、结肠组织病理学损伤评分均无显著差异（均P＞0.05）,CMDI评分显著升高（P＜0.05）;RNF183 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）,Ub、IκBα、NF-κB p65、NLRP3和IL-1β蛋白表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）。IF共定位结果显示,各组大鼠结肠组织中均存在IκBα和RNF183、IκBα和Ub的结合区域,提示IκBα与RNF183、Ub可能存在结合作用;Co-IP结果则进一步说明,RNF183与IκBα蛋白有结合作用。结论:1.艾灸能下调UC大鼠结肠组织NLRP3和IL-1β蛋白表达,该作用可能是其修复结肠炎性损伤、发挥抗炎作用的机制之一。2.艾灸能下调UC大鼠结肠Ub蛋白的表达,或是其调控NLRP3蛋白表达的途径之一。3.艾灸能下调UC大鼠结肠组织RNF183蛋白表达,抑制RNF183蛋白与IκBα的结合,减少IκBα蛋白泛素化及降解,抑制NF-κB信号通路活化,进而下调NLRP3及其下游炎症因子IL-1β蛋白表达,可能是其发挥抗炎作用的机制之一。
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