【摘 要】
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目的:从雌激素受体（Estrogen receptor,ER）着手,进行生肌化瘀方氯仿萃取物组分雌激素靶点筛选,研究其对人永生化角质形成细胞（Ha Ca T）增殖的影响,从对雌激素信号通路的活化作用探讨生肌化瘀方氯仿萃取物促进皮肤溃疡愈合的作用及分子机制。方法:应用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）分离生肌化瘀方氯仿萃取物单体组
【基金项目】
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国家自然科学基金（NO.81673866;NO.81704085）； 上海市教委曙光计划（NO.17SG41）； 国家重点研发计划“中医药现代化研究”重点专项（NO.2018YFC1705305）；
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目的:从雌激素受体（Estrogen receptor,ER）着手,进行生肌化瘀方氯仿萃取物组分雌激素靶点筛选,研究其对人永生化角质形成细胞（Ha Ca T）增殖的影响,从对雌激素信号通路的活化作用探讨生肌化瘀方氯仿萃取物促进皮肤溃疡愈合的作用及分子机制。方法:应用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）分离生肌化瘀方氯仿萃取物单体组分,随后采用微量热泳动（Microscale Thermophoresis,MST）技术确认9个生肌化瘀方氯仿萃取物候选组分是否与雌激素受体直接结合。以筛选得出的氯仿萃取物组分体外干预角质形成细胞,Cell counting kit-8（CCK-8）法、流式细胞术检测其对细胞增殖能力、细胞周期的影响,以从中筛选并明确具有促增殖效应的有效组分。RT-q PCR、Western blot技术检测雌激素信号通路活化作用相关基因c-myc、Fos B、Jun D在m RNA和蛋白水平的表达情况。结果:HPLC分离到的有效组分化合物群,以氯仿部位保留了最佳的复方组分比例,进一步佐证了氯仿部位活性最佳,经结构解析出有效化合物15个。MST检测结果显示,生肌化瘀方氯仿萃取物组分大黄酸与雌激素受体α、β直接结合,亲和力系数（Kd值）分别为407.01±75.97μM和289.44±18.59μM。CCK-8法检测和流式细胞术表明,生肌化瘀方氯仿萃取物组分大黄酸在25μM、50μM浓度时均能增加细胞周期S期细胞比例,促进角质形成细胞增殖,且50μM浓度下促增殖效应更为显著（P＜0.05）。雌激素受体抑制剂在1μM浓度下无细胞毒性,亦不影响角质形成细胞增殖（P＞0.05）。生肌化瘀方氯仿萃取物组分大黄酸在50μM浓度下能够上调c-myc、Fos B、Jun D在m RNA和蛋白表达（P＜0.05）,且上调c-myc的效应能被雌激素受体抑制剂阻断（P＜0.05）,而对Fos B、Jun D在m RNA和蛋白表达水平未见明显影响（P＞0.05）。结论:生肌化瘀方氯仿萃取物能促进皮肤溃疡创面愈合,其机制与氯仿萃取物组分大黄酸通过雌激素受体激活雌激素信号通路,与Fos B、Jun D协同诱导c-myc表达,发挥促进角质形成细胞增殖作用,进而加速再上皮化进程有关。
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