【摘 要】
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研究目的 术后瘢痕引起的张力是腭裂修复手术患者上颌骨生长受限的主要因素。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPKs)促进多种器官的纤维化。然而,它在硬腭术后瘢痕形成中的作用尚未被完全了解。本研究旨在研究p38MAPK基因在大鼠腭部瘢痕模型及大鼠腭部瘢痕成纤维细胞中的调节作用及作用机制。通过构建重组腺病毒载体来干扰p38MAP
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研究目的 术后瘢痕引起的张力是腭裂修复手术患者上颌骨生长受限的主要因素。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPKs)促进多种器官的纤维化。然而,它在硬腭术后瘢痕形成中的作用尚未被完全了解。本研究旨在研究p38MAPK基因在大鼠腭部瘢痕模型及大鼠腭部瘢痕成纤维细胞中的调节作用及作用机制。通过构建重组腺病毒载体来干扰p38MAPK基因的表达,检测抑制p38MAPK信号通路对大鼠腭部瘢痕成纤维细胞的影响,以及探讨p38MAPK对瘢痕的调节至少有一部分是通过调控心肌相关转录因子-A/血清反应因子(Myocardinrelated transcription factor A,MRTF-A/Serum response factor,SRF)通路实现的。阐明重组腺病毒载体介导的p38MAPK基因沉默对大鼠腭部瘢痕模型的治疗性作用和抗纤维化机制,为腭部瘢痕的治疗提供新的思路和方法。研究方法 1.构建大鼠腭部瘢痕模型并培养原代瘢痕成纤维细胞。2.构建可以在大鼠腭部成纤维细胞中沉默p38MAPK基因的腺病毒载体。3.用Ed U染色技术检验p38MAPK沉默对细胞增殖能力的影响。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),蛋白质印迹(Western Blot)和免疫荧光染色等手段探究p38MAPK沉默对I、III型胶原纤维(Type I collagen and type III collagen)和α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等瘢痕相关基因表达的影响。4.通过Western Blot和免疫荧光技术初步探究p38MAPK基因沉默对MRTF-A/SRF这一瘢痕密切相关信号通路的调节机制,主要从MRTF-A核内核外表达量的变化进行分析。5.在动物模型中验证沉默p38MAPK基因对瘢痕的抑制作用。将大鼠随机分为以下组:1)未手术组,2)未治疗组,3)阴性对照病毒组,和4)实验组。除未手术组外,手术切去所有大鼠左侧硬腭黏膜。手术两周后开始局部注射腺病毒载体,每周注射一次,直至大鼠3月龄。腺病毒载体治疗14天后,用免疫组织化学分析的方法评估了各组硬腭黏膜的组织学变化,探究p38MAPK沉默对α-SMA,胶原纤维和MRTF-A的调节作用。并在大鼠3月龄时测量硬腭宽度并计算上颌宽度比。实验结果 1.成功构建大鼠腭部瘢痕模型。瘢痕组织与正常黏膜相比,胶原纤维结构紊乱,表达更多的p38MAPK和α-SMA。2.重组腺病毒载体可以有效沉默瘢痕成纤维细胞中p38MAPK的表达,PCR结果显示沉默效率约为69%(P<0.05)。3.p38MAPK基因沉默不影响瘢痕成纤维细胞的增殖(P>0.05),但是沉默p38MAPK可以有效抑制瘢痕成纤维细胞中I、III型胶原和α-SMA的表达(P<0.05)。4.p38MAPK沉默通过直接抑制MRTF-A表达和改变G-action/F-actin的比例从而抑制MRTF-A入核这两种方式调控MRTF-A/SRF依赖的α-SMA转录(P<0.05)。5.在动物实验中,实验组的瘢痕组织中p38MAPK、α-SMA和胶原纤维的表达显著降低,上颌宽度比高于未治疗组和阴性对照病毒组(P<0.05)。结论 手术引起的瘢痕限制了上颌骨的发育。体内局部注射p38MAPK基因沉默序列可有效降低p38MAPK及瘢痕相关基因的表达,减弱瘢痕形成对硬腭发育的影响。从机制上讲,沉默成纤维细胞中的p38MAPK基因,可以通过抑制MRTF-A的产生和入核来减少α-SMA的表达。这些结果揭示了关于p38MAPK/MRTF-A介导的瘢痕形成的分子途径,并支持靶向p38MAPK作为硬腭术后瘢痕形成的潜在有效治疗方法。
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