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研究背景尽管血液安全检测体系建立数十年,临床用血和血液制品依然存在感染已知或者未知病原体的风险。基于高通量测序的宏基因组学方法可以应用于输血传播病原体的研究。通过深度测序和数据的生物信息分析检测血液中包含的病原体信息,监控来自新发病原体对输血安全的潜在威胁,以达到保障输血安全的目的。研究对象2016年4月至6月由广州血液中心常规筛查合格的献血者100人,以及单因ALT水平升高超出正常值范围的献血者200人。研究方法将血浆样本分为A,B,C3个组,其中A组为合格献血者,ALT值51-69IU/L为B组,70IU/L及以上为C组。3组样本分别以100份混合后,提取DNA和RNA,经MALBAC和随机PCR扩增后,将PCR产物进行深度测序,检测混合血浆样本中的微生物组,对部分可经输血传播的病原体进行样本的拆分鉴定,对病原体出现阳性结果的献血者进行随访和相关检测。随后,随机抽取1000份合格献血者,进行相关病原体的流行病学调查。研究结果1、建立了血液样本的宏基因组生物信息学分析流程,并应用于献血者人群血浆样本的宏基因组测序分析。经对A、B、C3组混合血浆DNA和RNA样本分别进行深度测序,发现细菌类病原体读取最多的序列是猪链球菌,真核生物类病原体读取最多的是双芽巴贝西虫,其次是刚地弓形虫。病毒类病原体读取较多的是EB病毒,但该病毒仅在C组样本中被读取到。根据测序结果,本文选择了以上4种病原体进行样本的拆分验证实验。2、猪链球菌感染特征。A、B和C组分别发现6例、2例和4例猪链球菌recN 片段（243bp）和 recN（1000bp）Nested-PCR 阳性的样本,其中 3 例 sodA（316bp）片段阳性,A、B、C三组各1例。系统进化分析发现阳性样本均与血清型1,2,14等3株处于同一进化分支的同一水平上。A、B、C 3组IgG抗体阳性率分别为2%、1%和1%。A组IgM抗体阳性率分别为1%,且IgM阳性的样本包含在6例PCR阳性样本中。12份样本成功随访到1例（A89）,且为IgM和核酸双阳性献血者。在Western blot确证检测中,仅发现A89号样本呈现蛋白阳性结果,且为IgM和IgG双阳性。随访样本recN片段（1000bp）和sodA片段Nested-PCR扩增均阳性,系统进化分析结果同前。随访前后qPCR结果显示该样本猪链球菌浓度呈现逐渐减弱趋势。随访者为重复献血者,个案调查其无猪链球菌感染的临床症状,感染的猪链球菌缺失致病基因SLY,判断该献血者携带的为猪链球菌致病型的无毒株。随访受血者,发现猪链球菌核酸和血清学均为阴性。3、巴贝西虫感染特征。A组发现4例,C组1例巴贝西虫SpeI-AvaI片段（170bp）Nested-PCR阳性的样本,说明A、C组存在巴贝西虫的感染。A、B、C3组IgG抗体阳性率分别为9%,1%和2%,IgM抗体阳性率分别为1%,3%和1%。A、B、C组核酸阳性和血清学检测阳性样本没有重合。对以上样本进行随访,但随访未成功。4、刚地弓形虫感染特征。A、B、C组分别发现10例,2例,8例刚地弓形虫18SrDNA片段Nested-PCR阳性的样本,A、B、C3组IgG抗体阳性率分别为4%,4%和5%,IgM抗体阳性率分别为1%,1%和0。在Western blot确证检测中,只检测到7个IgG阳性的样品,其中A组1例IgG阳性的样本（A91）包含在10例PCR阳性样本中。对以上阳性样本进行随访,成功随访到4例样本（A92,A96,A99和C62）。4例随访样本18SrDNA Nested-PCR扩增均为阳性,抗体有1例IgG抗体阳性（C62）,恰好为随访前IgG抗体阳性但18SrDNA阴性的样本,个案调查显示有养猫史,判断为1例隐性感染者。5、EB病毒感染特征。对C组样本进行EB病毒的血清学检测,发现EA-IgG抗体阳性率2%,EBNA-IgG抗体阳性率94%,VC A-IgA抗体阳性率3%,VC A-IgG抗体阳性率93%,VCA-IgM抗体阳性率3%,其中VCA-IgA和VCA-IgM双阳性样本2例。在EBNA-IgG和VC A-IgG抗体双阳性的样本中,检测到3例核酸阳性的样本,其中1例EA-IgG 阳性。抗体和核酸阳性的样本除ALT值较高外,GGT值也远远高于正常值上限,说明EBV感染对肝功能造成损害,是这几个样本ALT值升高的因素之一。6、放大样本的检测结果。对1000份血液筛查合格的样本进行巴贝西虫、猪链球菌及刚地弓形虫的Nested-PCR以及抗体检测,结果显示巴贝西虫、猪链球菌均无阳性结果,刚地弓形虫IgG 阳性率为0.6%。结论和意义1、建立血液样本宏基因组数据分析流程并应用于对献血者人群血浆混合样本的宏基因组分析,对输血安全产生威胁的病原体进行监测和评估。2、对宏基因组测序结果分析发现,献血者中存在猪链球菌、巴贝西虫和刚地弓形虫的感染,在输血常规筛查之外,应考虑在传染病高发季节制定相应的筛查策略,以减少相关病原体对输血安全的威胁。3、ALT值高于正常值上限2倍的献血者中存在EB病毒的急性感染,是否与高水平ALT有关需进一步证实。然而,ALT作为献血者常规筛查指标是否必要,是否进一步提高ALT正常值上限,需要更多研究数据支持和讨论。