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猪乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）感染猪群的中枢神经系统性、急性传染病,能引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎。猪细小病毒病（Porcine parvovirus infection,PPI）是由猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）引起猪的繁殖障碍性传染病,造成怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎等。目前,疫苗免疫是防控JE和PPI的有效措施,JE和PPI疫苗联合免疫具有简化猪场免疫程序、降低生产成本、减少动物应激等优点。因此,猪病防控亟需一针预防多病的联合疫苗,为养猪业健康发展提供保障。本研究将JEV GD毒株在Vero细胞上增殖,并对病毒感染时间、剂量等条件进行了优化,获得了高滴度的病毒液。以106.0 TCID50/m L的JEV GD毒株病毒感染小鼠进行致病性实验。将20只SPF级昆明小鼠随机分为两组,每组10只,实验组小鼠腹腔注射100μL JEV分离株病毒液,对照组小鼠腹腔注射100μL生理盐水。结果显示,感染JEV GD毒株的第4 d观察到实验组小鼠精神沉郁、活动力减弱、眼睑处分泌黄褐色粘液,10 d内小鼠全部发病、死亡,剖检发现脑组织充血、肿大。对照组小鼠活动正常,剖检未发现脑组织病变。以Gen Bank收录的猪PPV NJ株（AY686602.1）的VP2基因为基础,分别于N和C端引入蜂毒信号肽（Melittin）和His标签,人工合成重组基因rVP2。转移质粒载体p Fast Bac Dual是双启动子载体,将重组rVP2基因分别克隆到转移载体p Fast Bac Dual的polyhedrin（PH）和p10启动子下,经PCR、酶切鉴定、基因测序验证后获得重组转移质粒。将重组转移质粒p Fast Bac Dual-2rVP2转化至携带杆状病毒质粒Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经过蓝白斑筛选出的阳性克隆后用PCR技术检测其rVP2基因与Bacmid的重组情况。PCR结果显示,在2 000 bp、2 200 bp处存在特异性条带,大小与预期相符;酶切的结果显示,在1 800 bp、7 000 bp处存在特异性条带,大小与预期相符。结果表明,目的基因rVP2与Bacmid发生特异性重组,获得重组杆状病毒质粒r Bac-rVP2。将重组杆状病毒质粒r Bac-rVP2转染至sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-rVP2,将重组杆状病毒Ac-rVP2感染sf9细胞,感染后72 h通过Western blot和间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）检测细胞中重组蛋白rVP2的表达情况。Western blot结果显示,在67 k Da左右存在特异性条带,与重组蛋白rVP2分子大小相符;IFA结果显示,感染重组杆状病毒Ac-rVP2的sf9细胞在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,感染野生型杆状病毒的sf9细胞在荧光显微镜不能观察到荧光。分别以M.O.I.为0.1、1.0、10.0的重组杆状病毒Ac-rVP2感染High Five细胞,在感染后的第24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h收取细胞培养物,经超声破碎裂解细胞,用Western blot检测细胞样品中重组蛋白rVP2表达情况,通过Image J软件对该蛋白进行半定量分析。结果显示,重组杆状病毒Ac-rVP2感染High Five细胞24～96 h之间细胞内重组蛋白rVP2的含量逐渐增加;96 h后,细胞内重组蛋白rVP2的含量逐渐减少。当M.O.I.为1.0,感染后第96 h,检测到细胞培养物中重组蛋白rVP2表达水平最高,浓度可达380.5μg/m L。将10~6 TCID50/m L的JEV GD株病毒液用β-丙内脂灭活后与ISA 201VG佐剂按照1:1的体积比进行乳化,制备出JE灭活疫苗;将重组蛋白rVP2与ISA 201VG佐剂按照1:1的体积比进行乳化,制备出PPV重组蛋白rVP2亚单位疫苗;将重组蛋白rVP2与灭活后的JEV GD株病毒液等体积混合,然后与ISA 201VG佐剂按照1:1的比例乳化,制备PPI-JE（rVP2+GD株）二联疫苗。将疫苗免疫豚鼠以初步评估疫苗的免疫原性,实验分组如下:组1为JE灭活疫苗、组2为rVP2亚单位疫苗、组3为PPI-JE（rVP2+GD株）二联疫苗、组4为商品化JE灭活疫苗+PPI灭活疫苗、组5为PBS对照组。首次免疫后第14 d以相同剂量加强免疫。分别在首免前1 d、首免后7 d、14 d、21 d、28 d对各组豚鼠进行心脏采血,检测豚鼠血清中特异性抗体水平。结果显示,第二次免疫后第14 d,除PBS对照组,JE灭活疫苗组、PPI-JE（rVP2+GD株）二联疫苗组、商品JE灭活疫苗+PPI灭活疫苗组均产生较高水平的JEV特异性抗体,且各组间抗体水平无显著差异（P＞0.05）;rVP2亚单位疫苗组、PPI-JE（rVP2+GD株）二联疫苗组、商品JE灭活疫苗+PPI灭活疫苗组均产生较高水平的PPV特异性抗体,且各组间抗体水平无显著差异（P＞0.05）。综上所述,人工合成的基因rVP2能在High Five细胞中高效表达重组蛋白rVP2且具有较高抗原性,制备的PPI-JE（rVP2+GD株）二联疫苗能有效诱导豚鼠产生较高水平的PPV和JEV特异性抗体,为新型PPI-JE二联疫苗研制提供参考。