结肠癌是临床常见的恶性肿瘤，全世界每年被确诊为结肠癌的患者有约120万名，间接或直接因结肠癌死亡的患者超过60万名。随着中国人饮食结构的变化，结肠癌在我国的发病率逐年上升，是居于我国男性发病率第四位、死亡率第五位，女性发病率第三位、死亡率第四位的消化道疾病。化疗在结肠癌的综合治疗中起着重要的作用，但是结肠癌易对化疗药物产生耐药，从而导致肿瘤复发或转移，成为结肠癌化疗中一个非常棘手的问题。研究表明，结肠癌对化疗药物产生耐药与结肠癌细胞Bcl-2和P-糖蛋白(P-gp)等蛋白高表达，Bax等蛋白低表达有关。课题组前期发现重楼皂苷VII(PSVII)能够增加Bax的表达，降低Bcl-2的表达，激活Caspase-3和Caspase-9，从而诱导结肠癌细胞凋亡，显著抑制结肠癌细胞生长，具有抗耐药结肠癌的潜力。但是PSVII难溶于水，口服难以吸收，并且在体内分布无选择性，从而限制了其临床应用。因此，构建针对耐药结肠癌的主动靶向递药系统，使PSⅦ高效的进入耐药结肠癌细胞，是PSⅦ发挥抗耐药结肠癌的关键。本课题组发现在耐药结肠癌细胞中半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)高表达，文献报道改性柑橘果胶(MCP)可选择性地与Gal-3结合，提示MCP可作为结肠癌细胞靶向配体，介导递药系统富集于耐药结肠癌细胞。
　　目的：
　　以PSVII为活性药物，以MCP为耐药结肠癌细胞靶向配体和磷酸钙纳米粒(CaP-NP )的稳定剂，制备负载PSVII结肠癌靶向磷酸钙纳米粒(PSVII@MCP-CaP-NP)，旨在构建新型结肠癌靶向递药系统，增加PSVII在耐药结肠癌组织的分布，提高PSVII对耐药结肠癌的抑制作用。
　　方法：
　　(1)测定PSVII在不同介质中的平衡溶解度；通过测定PSVII的油水分配系数(lgPapp)及其在单层Caco-2细胞膜中的表观渗透系数(PCapp)，评价PSVII的生物药剂学性质。
　　(2)以PSVII为活性药物，以MCP为CaP-NP的稳定剂和结肠癌靶向配体，制备PSVII@MCP-CaP-NP，以粒径为指标，通过调整温度、钙磷比和MCP浓度等优化纳米粒的制备工艺处方。采用zeta电位及纳米粒度测定仪、透射电镜(TEM)及高效液相色谱(HPLC)考察PSⅦ@MCP-CaP-NP的粒径、zeta电位、形态及载药量。采用硫酸苯酚法测定PSⅦ@MCP-CaP-NP中MCP的量。采用透析法考察PSVII@MCP-CaP-NP的体外释药特性。
　　(3)采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察耐5-氟尿嘧啶结肠癌细胞(HCT116/Fu细胞)及耐奥沙利铂结肠癌细胞(HCT116/L细胞)对PSVII@MCP-CaP-NP的摄取情况。观察不同浓度游离MCP对耐药结肠癌细胞摄取PSVII@MCP-CaP-NP的影响。采用Westernblot方法检测Galectin-3在正常结肠上皮细胞(NCM460细胞)和结肠癌细胞(HCT116细胞、HCT116/Fu细胞和HCT116/L细胞)中的表达。
　　(4)通过MTT、克隆、迁移、侵袭实验，考察PSVII@MCP-CaP-NP对结肠癌细胞(HCT116细胞、HCT116/Fu细胞及HCT116/L细胞)增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。采用Westernblot方法检测PSVII@MCP-CaP-NP对HCT116细胞、HCT116/Fu细胞及HCT116/L细胞中Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-8、Cleavedcaspase-9、Bcl-2、Bax和P-糖蛋白(P-gp)等蛋白表达的影响。
　　(5)采用耐药结肠癌细胞(HCT116/Fu细胞和HCT116/L细胞)，建立体外3D耐药结肠癌细胞球模型，采用光学显微镜观察PSVII@MCP-CaP-NP对体外3D耐药结肠癌细胞球生长的抑制作用，采用CLSM观察PSVII@MCP-CaP-NP在3D耐药结肠癌细胞球中的分布。
　　(6)建立裸鼠原位耐奥沙利铂结肠癌模型，采用活体成像仪考察PSVII@MCP-CaP-NP在荷瘤裸鼠体内的分布，以及PSVII@MCP-CaP-NP对原位耐药结肠癌生长的抑制作用。采用Westernblot方法检测PSVII@MCP-CaP-NP对耐药结肠癌组织中Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-8、Cleavedcaspase-9、Bcl-2、Bax和P-gp等蛋白表达的影响，探讨PSVII@MCP-CaP-NP抑制原位耐药结肠癌生长的机制。
　　结果：
　　(1)PSVII在不同pH介质中，剂量数D0均大于1，PSVII在不同pH介质中的油水分配系数lgPapp均小于0。PSVII跨单层Caco-2细胞膜转运中不同时间点的转运速率PCapp小于14.96×10-6，表明PSVII的溶解性和渗透性均较低；维拉帕米和环孢菌素A对PSVII跨单层Caco-2细胞膜的转运速率无显著性影响，表明PSVII跨单层Caco-2细胞膜转运不经P-gp和多药耐药相关蛋白(MRP2)介导。
　　(2)制备PSVII@MCP-CaP-NP的最佳处方工艺为：温度为80℃，钙磷比为1:1，MCP浓度为15mg/mL。最佳处方工艺制备PSVII@MCP-CaP-NP的粒径为(104±8)nm，PDI为(0.210±0.012)，zeta电位为-(30.6±0.9)mV，PSVII载药量为(5.12±0.22)%，MCP的含量为(5.43±0.71)%；TEM结果显示PSⅦ@MCP-CaP-NP呈不规则球形或类球形；PSVII@MCP-CaP-NP在pH5.0的漏槽介质中在3h的累积释药量即达到55%，24h的累积释药量为82%；PSVII@MCP-CaP-NP在pH7.5的漏槽介质中3h的累积释药量为40%，24h的累积释药量为57%，表明PSVII@MCP-CaP-NP的体外释药具有pH响应特性。
　　(3)与NCM460细胞相比，Galectin-3在结肠癌细胞(HCT116细胞、HCT116/Fu细胞和HCT116/L细胞)中高表达。CLSM观察结果显示，耐药结肠癌细胞主要通过网格蛋白途径摄取PSVII@MCP-CaP-NP，HCT116/Fu细胞和HCT116/L细胞对PSVII@MCP-CaP-NP的摄取呈明显的时间依赖性和浓度依赖性，外加游离MCP可浓度依赖性地减少耐药结肠癌细胞对PSVII@MCP-CaP-NP的摄取，提示PSVII@MCP-CaP-NP可能通过Gal-3内吞，进入耐药结肠癌细胞。
　　(4 )PSVII@MCP-CaP-NP能够显著抑制HCT116细胞、HCT116/Fu细胞和HCT116/L细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移。PSVII@MCP-CaP-NP可显著增加HCT116/Fu细胞和HCT116/L细胞中Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9、Bax蛋白的表达，显著降低Bcl-2、P-gp蛋白的表达。
　　(5)成功构建了体外3D耐药结肠癌细胞球模型。PSVII@MCP-CaP-NP可渗透到体外3D耐药结肠癌细胞球较深区域，并且能显著抑制体外3D耐药结肠癌细胞球的生长，作用强于游离PSVII。
　　(6 )成功建立了裸鼠原位耐奥沙利铂结肠癌模型。PSVII@MCP-CaP-NP和PSVII对原位耐药结肠癌的生长具有明显的抑制作用，并且PSVII@MCP-CaP-NP对原位耐药结肠癌生长的抑制作用明显强于PSVII。活体成像结果表明PSVII@MCP-CaP-NP可有效地蓄积于耐药结肠癌组织中，而在其它器官组织中分布较少。荷瘤裸鼠注射给予PSVII@MCP-CaP-NP，24h后在耐药结肠癌组织中仍能观察到大量的药物分布。H&E结果表明PSVII@MCP-CaP-NP能选择性地抑制耐药结肠癌细胞增殖，并且减轻PSVII对脾脏、肾脏等组织器官的毒性。PSVII@MCP-CaP-NP能够显著增加耐药结肠癌组织中Cleavedcaspased-3、Cleavedcaspased-9、Bax蛋白的表达，显著降低Bcl-2、P-gp蛋白的表达。
　　结论：
　　PSVII属于低溶解性、低渗透性药物。PSVII@MCP-CaP-NP能够明显抑制耐5-氟尿嘧啶和耐奥沙利铂结肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭；PSVII@MCP-CaP-NP具有结肠癌靶向作用，能够在耐药结肠癌组织中有效蓄积，抑制裸鼠原位耐奥沙利铂结肠癌生长。PSVII@MCP-CaP-NP的上述作用与其提高耐药结肠癌组织中Cleavedcaspased-3、Cleavedcaspased-9、Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达有关，通过线粒体通路促进耐药结肠癌细胞的凋亡。本课题为结肠癌靶向给药系统的构建提供了新方法，为PSⅦ的开发利用探索了新思路。