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研究背景:银屑病是一种慢性免疫炎症性复杂疾病,由遗传和环境等风险因素共同导致。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV,CaMK4)在银屑病中的作用仍不清楚。本研究的目的是探索CaMK4在银屑病发病中作用及其机制。研究方法:首先,我们使用免疫组化检测了CaMK4在银屑病患者皮损中的表达,定量PCR和流式细胞术检测了CaMK4在银屑病患者外周血细胞中的表达。其次,我们使用免疫组化检测了CaMK4在咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的小鼠银屑病皮损中的表达;接下来我们分离了原代角质形成细胞(keratinocytes,KCs)以及使用磁珠分选了小鼠皮肤中免疫细胞亚群,并使用western blot和定量PCR检测了CaMK4在不同细胞中的表达。确定了CaMK4在银屑病中的表达后,我们构建了Camk4敲除(Camk4-/-)小鼠,IMQ造模后,观察其银屑病炎症与野生型(Camk4+/+)小鼠的差异,并使用流式细胞术检测了皮肤中髓系细胞和T细胞亚群的变化。为了寻找CaMK4的作用机制,我们进一步使用免疫组化、定量PCR、免疫荧光、流式细胞术检测了IMQ诱导的小鼠银屑病皮损和巨噬细胞中IL-10的表达,以及结合体外细胞实验去寻找确切的分子机制。随后,我们进行了小鼠体内骨髓来源的巨噬细胞过继转输、外源性IL-10注射、IL-10中和抗体注射实验,进一步去证实前期的实验结果。为了直接评估巨噬细胞中Camk4缺失对银屑病的影响,我们构建了髓系细胞特异性Camk4敲除(Camk4fl/fl Lyz2-Cre)小鼠,IMQ造模后,观察银屑病炎症以及使用定量PCR和流式细胞术检测相关细胞因子和细胞亚群的变化。我们还使用小干扰RNA技术探索了CaMK4在角质形成细胞中的作用。最后,我们使用CaMK4小分子抑制剂评估了以CaMK4为靶点来治疗银屑病的效果。研究结果:首先,我们检测了CaMK4在银屑病患者皮损和外周血细胞中的表达。免疫组化检测结果显示CaMK4在银屑病患者皮损中的表达显著高于其在健康对照皮肤中的表达;定量PCR检测结果显示CAMK4在银屑病患者外周血细胞中的表达较健康对照上调,流式细胞术检测结果显示银屑病患者外周T细胞亚群和CD14+单核细胞中CaMK4阳性细胞的比例和平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)均高于健康对照,且银屑病患者和健康对照外周CD14+单核细胞中CaMK4的表达高于T细胞亚群。其次,我们检测了CaMK4在IMQ诱导的银屑病小鼠中的表达。免疫组化检测结果显示CaMK4在IMQ诱导的小鼠银屑病皮损中的表达上调;western blot和定量PCR检测结果显示CaMK4在IMQ诱导的小鼠银屑病皮损F4/80+细胞、CD11c+细胞、原代角质形成细胞中的表达较对照上调,但在B细胞和中性粒细胞中的表达无变化。随后,我们发现IMQ诱导的Camk4-/-小鼠银屑病严重程度较IMQ诱导的Camk4+/+小鼠减轻。RNA测序和定量PCR检测结果显示IMQ诱导的Camk4-/-小鼠银屑病皮损中致病因子S100a8、S100a9、Il1b、Il17a、Il17f、Il22、Ccl20的表达显著低于IMQ诱导的Camk4+/+小鼠。与Camk4+/+小鼠相比,IMQ诱导的Camk4-/-小鼠银屑病皮损中IL-17A+γδT细胞和树突状细胞(dendritic cells,DCs)减少,巨噬细胞增多,增多的巨噬细胞与减少的IL-17A+γδT细胞呈负相关。接下来,我们检测了IMQ诱导的小鼠银屑病皮损和巨噬细胞中IL-10的表达。定量PCR和免疫组化检测结果显示IMQ诱导的Camk4-/-小鼠银屑病皮损中IL-10基因和蛋白水平显著高于IMQ诱导的Camk4+/+小鼠;免疫荧光和流式细胞术检测结果显示IMQ诱导的Camk4-/-小鼠真皮巨噬细胞中IL-10的表达较IMQ诱导的Camk4+/+小鼠增多。体外实验证实了CaMK4通过下调ADCY1-c AMP-Erk1/2和p38信号通路抑制巨噬细生成IL-10,且CaMK4限制了M2巨噬细胞极化和巨噬细胞吞噬功能。小鼠体内骨髓来源的巨噬细胞过继转输、外源性IL-10注射、IL-10中和抗体注射实验进一步证实了Camk4缺失可以恢复巨噬细胞中IL-10的生成,从而减轻IMQ诱导的银屑病炎症。我们还发现巨噬细胞中Camk4缺失减轻IMQ诱导的银屑病炎症。此外,我们发现CaMK4通过AKT-NF-κB信号通路抑制角质形成细胞凋亡、促进细胞增殖和促炎基因的表达。最后,药理性抑制CaMK4显著缓解了IMQ诱导的银屑病炎症。结论:我们的研究证明了CaMK4在真皮巨噬细胞和表皮角质形成细胞中发挥重要作用来影响银屑病发展。在真皮巨噬细胞中,CaMK4通过下调ADCY1-c AMP-Erk1/2和p38信号通路抑制IL-10的生成;在表皮角质形成细胞中,CaMK4-AKT-NF-κB信号通路促进角质形成细胞促炎表型。这不仅揭示CaMK4在银屑病发病中新的作用机制,而且为银屑病的治疗提供潜在的靶点和理论依据。