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研究背景:甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤,近几十年来,其发病率逐渐升高并趋于年轻化,而甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是甲状腺癌中最常见的病理分型,其发病率高达80%以上。PTC虽属于惰性肿瘤,但部分PTC患者在早期确诊时即可出现颈部淋巴结转移,且转移率高达30%左右,严重影响患者的生活质量及预后。因此,进一步揭示参与PTC进展的潜在作用机制,寻找助于抗PTC诊疗的干预靶点,进而对提高PTC的早诊率及改善预后具有重要意义。细胞的异常增殖是导致肿瘤发生发展的一个至关重要的因素,而细胞周期的异常调节是引起细胞异常增殖的的始动因素,细胞分裂周期相关蛋白的异常表达可直接引起细胞的分裂、增殖及凋亡等生物学过程的异常调控。细胞分裂周期相关蛋白2（cell division cycle-associated protein 2,CDCA2）是细胞分裂周期相关蛋白家族中的一个重要成员,在细胞分裂周期中CDCA2受CDKl与Aurora B蛋白激酶和蛋白磷酸酶1与蛋白磷酸酶2A的双向调节,CDCA2与细胞的有丝分裂、染色质重塑、核膜重组及DNA损伤反应的修复等功能密切相关。在细胞周期中CDCA2与染色质的可逆性结合,对调节细胞正常的分裂起着至关重要的作用。目前研究报道,CDCA2在部分恶性肿瘤组织中相对高表达,且与患者的不良预后相关,同时肿瘤细胞的功能学研究也提示CDCA2可促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞凋亡,继而诱发肿瘤细胞的侵袭转移等恶性行为。因此,CDCA2可能成为一个新的潜在的抗肿瘤靶标,目前CDCA2在PTC发生发展中的生物学作用及预后评价尚不清楚,且CDCA2参与调控PTC恶性生物学行为的机制也不明确。所以,本课题对CDCA2在PTC进展中的作用及调控机制进行研究。研究方法:1、利用Oncomine数据库分析CDCA2在人PTC组织和癌旁组织中的表达情况。然后收集80例手术切除的PTC患者癌组织和癌旁2cm甲状腺正常组织（术后病理证实未发现肿瘤细胞）。应用免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）检测PTC和癌旁正常组织中CDCA2阳性染色率。Westen Blot蛋白印迹及实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chainreaction,q RT-PCR）法检测PTC组织和配对癌旁正常组织中CDCA2蛋白及m RNA的表达水平,并分析CDCA2表达与PTC患者临床病理特征之间的关系。2、培养甲状腺乳头状癌细胞系（K1、TPC-1）和甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori-3-1）,检测CDCA2蛋白和m RNA在PTC细胞中的表达情况。利用质粒和慢病毒工具分别转染K1和TPC-1细胞,用Western Blot及q RT-PCR方法检测CDCA2蛋白及m RNA的表达水平,评估转染效率,构建和筛选稳定敲减或过表达CDCA2基因的K1和TPC-1细胞系。3、通过MTS、Ed U及平板克隆形成实验检测CDCA2对PTC细胞活性及增殖能力的影响;利用划痕实验及Transwell侵袭实验检测CDCA2对PTC细胞迁移和侵袭能力的影响;运用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测CDCA2对PTC细胞凋亡的影响;利用碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色流式细胞术检测CDCA2对PTC细胞周期的影响。4、应用Western Blot蛋白印迹法检测改变PTC细胞中CDCA2基因表达后对细胞周期蛋白（Cyclin Dl）、细胞周期蛋白（Cyclin E）、抗凋亡因子（Bcl-2）、凋亡促进因子（Bax）蛋白表达的影响;检测PI3K/AKT信号通路中p-PI3K、PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表达水平;以及上皮细胞间质化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和基质金属蛋白酶2/9（MMP-2/9）表达的影响。5、PTC细胞过表达组进行回复实验,分组为未转染组、CDCA2过表达组及CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,检测对PTC细胞生物学功能的影响,以及上述实验中相关蛋白的表达。6、应用稳转CDCA2基因的TPC-1细胞构建裸鼠移植瘤模型,分为敲减组、敲减空载组、未转染组、过表达空载组、过表达组（5只/组）,观察移植瘤的生长情况,待28天成瘤后将小鼠处死,并测量各组肿瘤体积及重量。应用Westen Blot蛋白印迹检测移植瘤组织中CDCA2蛋白、EMT标志物及PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的表达水平。结果:1、检索Oncomine数据库的结果提示,CDCA2在人PTC组织中呈明显高表达（p＜0.01）。IHC结果显示,癌旁正常组织中CDCA2阳性表达率为11.25%（9/80）,PTC组织中CDCA2阳性表达率为76.25%（61/80）（p＜0.05）。Western Blot及q RT-PCR结果显示,PTC组织中CDCA2蛋白及m RNA相对表达量明显高于正常组织（p＜0.05）,且CDCA2的高表达与淋巴结转移及肿瘤多灶性密切相关（p＜0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小及包膜侵犯之间无统计学差异（p＞0.05）。2、Western Blot及q RT-PCR实验结果显示,与Nthy-ori-3-1细胞相比,K1和TPC-1细胞中CDCA2蛋白和m RNA的表达水平明显升高（p＜0.05）。与未转染组（con）和敲减空载组（neg-sh RNA）相比,敲减组（CDCA2-sh RNA）中CDCA2蛋白及m RNA相对表达量明显降低（p＜0.05）,而con组和neg-sh RNA组间差异无统计学意义（p＞0.05）。与con组和过表达空载组（pc DNA3.3）相比,过表达组（pc DNA3.3-CDCA2）中CDCA2蛋白及m RNA的表达量明显提高（p＜0.05）,而con组和pc DNA3.3组间无统计学差异（p＞0.05）,说明稳定敲减和过表达CDCA2基因的PTC细胞株构建成功。3、MTS、Ed U及平板克隆实验结果提示CDCA2促进PTC的增殖能力。MTS法:CDCA2-sh RNA组中PTC细胞增殖能力与con组和neg-sh RNA组细胞增殖能力相比明显减弱（p＜0.05）;Ed U法:CDCA2-sh RNA组中PTC细胞平均细胞计数明显低于con组和neg-sh RNA组平均细胞计数（p＜0.05）;平板克隆形成实验:CDCA2-sh RNA组PTC细胞平均细胞集落数量明显低于con组和neg-sh RNA组中平均细胞集落数量（p＜0.05）,以上三种方法中,con组和neg-sh RNA组间均无明显差异（p＞0.05）。相反,用相同的方法检测CDCA2基因过表达后对PTC细胞增殖能力的影响。结果提示,与con组和pc DNA3.3组相比,pc DNA3.3-CDCA2组中PTC细胞增值能力明显增强（p＜0.05）,而con组和pc DNA3.3组间差异无明显统计学意义（p＞0.05）。4、Transwell侵袭和划痕实验结果表明CDCA2能增强PTC细胞的迁移侵袭能力。在PTC细胞中,与con组和neg-sh RNA组相比,CDCA2-sh RNA组中Transwell侵袭实验平均细胞计数明显减少（p＜0.05）;划痕实验检测PTC细胞迁移率,CDCA2-sh RNA组中细胞平均愈合面积百分比明显降低（p＜0.05）,而con组与neg-sh RNA组间差异均无统计学意义（p＞0.05）。相反,同样方法检测CDCA2基因过表达后对PTC细胞迁移侵袭能力的影响,结果提示,与con组和pc DNA3.3组相比,pc DNA3.3-CDCA2组PTC细胞迁移侵袭能力明显增强（p＜0.05）,而con组与pc DNA3.3组间无统计学差异（p＞0.05）。5、Annexin V-FITC/PI双染流式实验结果提示CDCA2可抑制PTC细胞的凋亡。在PTC细胞中,CDCA2-sh RNA组中细胞凋亡率明显高于con组与neg-sh RNA组（p＜0.05）,而con与neg-sh RNA组间无统计学差异（p＞0.05）。相反,pc DNA3.3-CDCA2组PTC细胞凋亡率明显低于con组与pc DNA3.3组（p＜0.05）,而con和pc DNA3.3组间无明显差异（p＞0.05）。PI染色结果提示,在PTC细胞中,与con组和neg-sh RNA组相比,CDCA2-sh RNA组中细胞的G0-G1期比例增多、S期比例明显减少（P＜0.05）,G2-M期比例无明显变化差异（p＞0.05）,而con组与neg-sh RNA组间各期差异无统计学意义（p＞0.05）。相反,过表达CDCA2基因后可促进PTC细胞由G0-G1期向S期的过渡,pc DNA3.3-CDCA2组中G0-G1期比例减少、S期比例明显增多（p＜0.05）,G2-M期比例无明显变化（p＞0.05）,而con组与pc DNA3.3组间各期无明显差异（p＞0.05）。6、Western blot检测敲减PTC细胞中CDCA2基因后,Cyclin Dl、Cyclin E、Bcl-2、Bax、MMP2/9蛋白表达水平的变化。结果显示,CDCA2-sh RNA组中Cyclin Dl、Bcl-2及MMP2蛋白相对表达量明显低于con组和neg-sh RNA组（p＜0.05）,而CDCA2-sh RNA组中Bax蛋白相对表达量明显高于con组和neg-sh RNA组（p＜0.05）。过表达PTC细胞中CDCA2基因后,pc DNA3.3-CDCA2组中Cyclin Dl、Bcl-2及MMP2蛋白相对表达量明显高于con组和pc DNA3.3组,而pc DNA3.3-CDCA2组中Bax蛋白相对表达量明显低于con组和pc DNA3.3组（p＜0.05）,以上蛋白在con组、neg-sh RNA组及pc DNA3.3组间表达差异均无统计学意义（p＞0.05）。调控PTC细胞中CDCA2基因表达后对Cyclin E及MMP-9蛋白水平变化无明显影响。Western blot检测改变PTC细胞中CDCA2基因表达后对PI3K/AKT信号通路及EMT中相关蛋白表达水平的影响。结果显示,vimentin、p-PI3K及p-AKT蛋白相对表达量在CDCA2-sh RNA组中明显低于con组和neg-sh RNA组,而E-cadherin在CDCA2-sh RNA组中明显升高（p＜0.05）。相反,PTC细胞过表达CDCA2基因后,vimentin、p-PI3K及p-AKT蛋白相对表达量在pc DNA3.3-CDCA2组中明显高于con组和pc DNA3.3组,而E-cadherin在pc DNA3.3-CDCA2组中明显降低（p＜0.05）。而这些蛋白在con组、neg-sh RNA组及pc DNA3.3组间表达差异均无统计学意义（p＞0.05）。调控PTC细胞中CDCA2基因表达后对N-cadherin、PI3K及AKT蛋白水平无明显影响。7、pc DNA3.3-CDCA2组加PI3K抑制剂进行回复实验。在PTC细胞中,与pc DNA3.3-CDCA2+PI3K抑制剂组相比,pc DNA3.3-CDCA2+dd H2O组中p-PI3K、p-AKT及PI3K蛋白水平明显升高,组间差异均有统计学意义（p＜0.05）,提示PI3K抑制剂能有效抑制PI3K/AKT信号通路的活性（p＜0.05）。功能试验结果提示,pc DNA3.3-CDCA2组增殖、迁移及侵袭能力明显高于CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,而CDCA2过表达+PI3K抑制剂组高于con组（p＜0.05）;Annexin V-FITC及PI双染流式提示,PTC细胞pc DNA3.3-CDCA2组凋亡率低于CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,CDCA2过表达+PI3K抑制剂组凋亡率低于con组（p＜0.05）;PTC细胞pc DNA3.3-CDCA2组G0-G1期比例低于CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,CDCA2过表达+PI3K抑制剂组低于con组,pc DNA3.3-CDCA2组S期比例高于CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,CDCA2过表达+PI3K抑制剂组高于con组,以上各个组间差异均有统计学意义（p＜0.05）。Western blot检测提示,PTC细胞pc DNA3.3-CDCA2组中Cyclin Dl、Bcl-2、MMP2、vimentin、p-PI3K及p-AKT蛋白相对表达量明显高于CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,而CDCA2过表达+PI3K抑制剂组明显高于con组;pc DNA3.3-CDCA2组中Bax、E-cadherin蛋白相对表达量明显低于CDCA2过表达+PI3K抑制剂组,CDCA2过表达+PI3K抑制剂组低于con组,以上蛋白在三组间差异均有统计学意义（p＜0.05）,而三组间Cyclin E、MMP-9、N-cadherin及AKT蛋白表达水平无明显改变（p＞0.05）。8、裸鼠移植瘤实验,肿瘤生长曲线提示,CDCA2-sh RNA组生长速度最慢,而pc DNA3.3-CDCA2组最快;瘤体的体积及重量提示,CDCA2-sh RNA组最低,pc DNA3.3-CDCA2组最高,差异均有统计学意义（p＜0.05）,而con组、neg-sh RNA组及pc DNA3.3组三者间无明显差异（p＞0.05）,CDCA2可促进TPC-1细胞裸鼠体内移植瘤的生长。Western Blot结果显示,与con组、neg-sh RNA组及pc DNA3.3组相比,CDCA2蛋白的表达量在CDCA2-sh RNA组中明显降低（p＜0.05）,pc DNA3.3-CDCA2组中明显升高（p＜0.05）。裸鼠移植瘤组织中PI3K/AKT及EMT相关蛋白水平的变化,结果显示,与con组、neg-sh RNA组及pc DNA3.3组相比,vimentin、p-PI3K及p-AKT蛋白的表达量在CDCA2-sh RNA组中明显降低,pc DNA3.3-CDCA2组中明显升高（p＜0.05）;CDCA2-sh RNA组中E-cadherin蛋白表达量明显升高,而pc DNA3.3-CDCA2组表达量明显降低（p＜0.05）,但以上蛋白在con组、neg-sh RNA组及pc DNA3.3组间差异无统计学意义（p＞0.05）。结论:1、在甲状腺乳头状癌的患者中,CDCA2蛋白及m RNA在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,差异有统计学意义;且其表达水平与PTC者的淋巴结转移及肿瘤多灶性密切相关,说明CDCA2的高表达可能在PTC的进展中发挥一定的作用。2、CDCA2能明显促进PTC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,同时抑制PTC细胞的凋亡。3、CDCA2通过PI3K/AKT信号通路调控PTC细胞的增殖、迁移、侵袭以及EMT。CDCA2通过PI3K/AKT信号通路促进TPC-1细胞裸鼠皮下移植瘤的形成。