【摘 要】
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[目 的]细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,cagA)为幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,Hp)的主要毒力基因,cagA 阳性 Hp(cagA+Hp)感染感染与胃癌发生直接相关,但其致癌机制尚未明了。我们前期研究发现Semaphorin 5A(SEMA5A)基因在胃癌及其癌前病变中的异常表达与Hp感染有关,进一步研究表明 SEMA5A、转
【基金项目】
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基金项目国家自然科学基金(81660413); 云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(2019FE001-211);
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[目 的]细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,cagA)为幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,Hp)的主要毒力基因,cagA 阳性 Hp(cagA+Hp)感染感染与胃癌发生直接相关,但其致癌机制尚未明了。我们前期研究发现Semaphorin 5A(SEMA5A)基因在胃癌及其癌前病变中的异常表达与Hp感染有关,进一步研究表明 SEMA5A、转化生长因子 β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)在胃癌组织中均高表达。但其促进胃癌发生的机制仍不清楚,本研究重点为明确cagA+Hp感染是否通过SEMA5A基因激活TGF-β1,进而通过其下游Smad通路和/或非Smad信号通路促进胃癌的发生。该研究成果将为不同地区有效治疗Hp感染及胃癌防治、早期诊断提供新的理论。[方法]1.首先,利用Real-time RT-qPCR检测胃癌组织中SEMA5A基因表达与cagA+Hp感染的相关性;cagA+Hp感染胃癌细胞株AGS和SGC7901后,通过RT-qPCR和Western Blot方法比较感染前后SEMA5A基因表达的变化。2.其次,使用慢病毒包装系统在AGS及SGC7901细胞中构建SEMA5A敲低稳转株细胞,并经嘌呤霉素筛选及扩大培养后,通过RT-qPCR、Western Blot对稳转株细胞进行鉴定,在mRNA和蛋白质水平检测SEMA5A的表达效率。使用cagA+Hp感染构建成功的SEMA5A稳定转细胞株shSEMA5A及其阴性对照组(NC组)细胞,RT-qPCR和Western Blot方法检测感染前后TGF-β1的表达水平。3.使用cagA+Hp感染shSEMA5A组细胞及其NC组细胞,同时加入等浓度的TGF-β1抑制剂,通过CCK-8、克隆形成实验、划痕实验、侵袭实验检测TGF-β1对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。4.使用cagA+Hp感染shSEMA5A组以及各自的NC组细胞,Western Blot检测 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD2/3、SMAD4 表达情况和 p-SMAD2/3表达水平,以及ERK、P38MAPK、JNK和AKT磷酸化和非磷酸化的表达情况;应用免疫荧光方法检测cagA+Hp感染前后Smad2在胃癌细胞内定位的变化。将cagA+Hp与shSEMA5A细胞及其对照组细胞共培养后,加入PI3K/AKT抑制剂,通过CCK-8、侵袭实验检测AKT信号通路对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。[结 果]1.在临床组织样本中,cagA+Hp在癌旁组织中的表达高于胃癌组织,且SEMA5A基因在cagA+Hp胃癌组织中的表达高于cagA-Hp胃癌组织。在体外实验中,随着cagA+Hp与胃癌细胞共培养的时间及浓度的增加,SEMA5A基因的表达也随之增加。表明在胃癌中SEMA5A的表达与cagA+Hp呈正相关。2.与NC组相比,shSEMA5A组的SEMA5A mRNA和蛋白的表达明显降低,TGF-β1 mRNA和蛋白的表达均下调,提示SEMA5A正向调控TGF-β1的翻译水平。相较于NC组,shSEMA5A组细胞的增殖、迁移、侵袭能力均降低,且TGF-β1抑制剂P144处理组细胞的增殖、迁移及侵袭能力均低于未处理组。提示TGF-β1能够促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。3.与 NC 组相比,shSEMA5A 组 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD4、p-SMAD2/3表达水平下调,磷酸化ERK1/2、JNK、AKT、P38表达水平降低,cagA+Hp感染后,表达水平虽有上升,但shSEMA5A组的表达仍低于NC组,总SMAD2/3、ERK1/2、JNK、AKT、P38蛋白水平无明显变化。SMAD2定位于细胞核,shSEMA5A组荧光表达弱于NC组。PI3K/AKT抑制剂LY294002处理组细胞增殖、及侵袭能力均低于未处理组,且与SEMA5A的表达呈正相关。提示SEMA5A可能通过TGF-β1介导的Smad和非Smad信号通路促进胃癌的增殖,迁移及侵袭。[结 论]1.cagA+Hp感染对SEMA5A基因在胃癌细胞株中的表达具有正向调控作用。2.SEMA5A基因与TGF-β1表达呈正相关,cagA+Hp感染通过SEMA5A激活TGF-β1并依赖其介导的Smad和非Smad信号通路,促进胃癌的增殖,迁移及侵袭。
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