【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）严重威胁养猪业,尽快研发有效的新型疫苗是预防本病的重点。其中,复制缺陷型疫苗因其安全性具有一定的研究价值。为拯救ORF4复制缺陷型PRRSV,本研究按照以下三部分进行:（1）PRRSV GP4单克隆抗体的制备:截短表达重组猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖蛋白4（GP4）并纯化,重组GP4免疫小鼠制备GP4单克隆抗体。SDS-PAGE结果表明,重组GP4以上清形式
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猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）严重威胁养猪业,尽快研发有效的新型疫苗是预防本病的重点。其中,复制缺陷型疫苗因其安全性具有一定的研究价值。为拯救ORF4复制缺陷型PRRSV,本研究按照以下三部分进行:（1）PRRSV GP4单克隆抗体的制备:截短表达重组猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖蛋白4（GP4）并纯化,重组GP4免疫小鼠制备GP4单克隆抗体。SDS-PAGE结果表明,重组GP4以上清形式成功表达。WB和IFA结果表明,单克隆抗体Anti-A-GP4-70制备成功且与抗原特异性结合。（2）构建稳定表达PRRSV ORF4基因的Marc-145细胞系:以全长c DNA感染性克隆质粒p JXwn06为模板构建重组慢病毒质粒p LV-EF1a-EGFP-2A-ORF4,脂质体转染HEK293FT细胞后收取慢病毒并转导Marc-145细胞,通过嘌呤霉素和有限稀释法筛选细胞系Marc-145-GP4,利用所制备单克隆抗体进行验证。PCR、RT-PCR结果表明,ORF4基因成功整合到细胞染色体且可进行正常转录翻译。WB、IFA结果表明,ORF4基因在Marc-145细胞上成功表达。（3）利用反式互补拯救ORF4复制缺陷型PRRSV:以全长c DNA感染性克隆质粒p JXwn06为模板,利用Overlap PCR构建重组c DNA感染性克隆缺失质粒p JXwn06-△ORF4。通过体外转录和电转染,利用细胞系Marc-145-GP4反式互补拯救复制缺陷型病毒r JXwn06-△ORF4。PCR、IFA结果表明,复制缺陷型病毒拯救成功,且只能在表达ORF4基因的Marc-145细胞系中生长繁殖。本研究为PRRS的快速检测及GP4功能研究奠定基础,为PRRS新型复制缺陷型疫苗提供候选毒株。
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