论文部分内容阅读
胃癌(Gastric cancer,GC)在全球范围内是肿瘤相关死亡的主要原因,排在所有肿瘤的第5位。尽管治疗策略在不断改进和提高,胃癌患者的预后仍不尽人意。侵袭和转移是胃癌的重要生物学特征,也是导致患者预后不良的主要原因。因此,深入探究胃癌侵袭转移的分子机制对于发现胃癌治疗新的靶点并发展胃癌治疗新策略具有十分重要的意义。黏附斑在细胞骨架蛋白和细胞外基质之间的连接以及细胞外信号向细胞内的传导等方面发挥重要作用。斑联蛋白(Zyxin,ZYX)是黏附斑的主要组成成分,其含有LIM结构域,能充当多种蛋白分子的脚手架介导多种蛋白间的相互作用而调控细胞的黏附、增殖和迁移。ZYX还可穿梭于细胞核和细胞质,与相关转录因子相互作用从而在调控转录中发挥作用。近年来,ZYX在肿瘤中的作用受到关注,已报道其在黑色素瘤,肝癌,口腔鳞癌,尤文氏肉瘤和前列腺癌等肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移中发挥重要作用。但ZYX在胃癌的作用尚无报道。本研究检测了胃癌组织中ZYX的表达,并分析了其表达水平与临床病理参数及临床预后的关系;研究了ZYX促进胃癌细胞侵袭转移的作用,并用一系列体内外实验探讨了其可能的分子机制。此外我们还初步探讨了ZYX在胶质瘤迁移、侵袭中的作用。本研究的主要方法、结果和结论如下:1.ZYX在胃癌组织的表达及其临床病理学意义(1)ZYX在胃癌组织中高表达以免疫组化染色(immunohistochemistry stain,IHC)方法对含有208例胃癌组织的组织芯片和17例癌旁组织进行了ZYX表达检测,结果显示ZYX在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织(p<0.0001)。为验证IHC结果,实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测6对新鲜胃癌组织及癌旁组织中ZYX的表达,结果表明无论在mRNA水平还是在蛋白水平上,胃癌组织中ZYX的表达都显著高于癌旁组织。TCGA数据库数据的分析结果(p<0.05)也佐证了我们的实验结果。(2)ZYX在胃癌组织中的表达水平与临床病理参数呈正相关而与患者预后呈负相关用SPSS20.0对208例胃癌组织的IHC得分绘制ROC曲线,得到Cutoff值为7.0。根据Cutoff值将胃癌患者分为ZYX高表达组和低表达组。然后分析了ZYX的表达和胃癌患者临床病理参数的相关性,结果表明ZYX的表达水平与肿瘤大小(p=0.015)、T分期(p=0.002)、N分期(p=0.001)和TNM分级(p=0.026)显著相关。Kaplan–Meier生存分析结果显示高表达ZYX的胃癌患者具有更短的总生存期(overall survival,OS)(p<0.0001)和无进展生存期(progression free survival,PFS)(p<0.0001),KMPLOT的数据分析佐证了我们的实验结果。单因素方差分析和多因素方差分析表明ZYX可以作为胃癌的一个独立预后指标。2.ZYX促进胃癌细胞迁移、侵袭和转移能力(1)ZYX过表达的XN0422细胞和ZYX敲低的MGC803细胞的构建首先用qRT-PCR及WB筛查了ZYX在胃黏膜上皮细胞(GES-1)和几个本研究所常用胃癌细胞系BGC823、,MGC803、SGC7901及XN0422(本室保存的原代胃癌细胞系)中的表达,结果表明各胃癌细胞系中ZYX的表达均显著高于正常胃黏膜上皮细胞。在胃癌细胞系中,MGC803的ZYX表达水平最高,而XN0422的表达水平较低,因此被分别用慢病毒方法构建成ZYX敲低和ZYX过表达模型,并经qRT-PCR和WB验证其效率后用于后续实验。(2)ZYX促进胃癌细胞体外迁移和侵袭能力划痕实验结果显示,相较于对照细胞,过表达ZYX显著增强XN0422的迁移能力(p=0.0001),敲低ZYX则显著降低MGC803的迁移能力(p<0.0001)。与迁移实验结果相一致,Metrigel-transwell侵袭实验也表明,相较于对照细胞,过表达ZYX显著增强XN0422的侵袭能力(p<0.0001),而敲低ZYX显著降低MGC803的侵袭能力(p<0.0001)。(3)ZYX促进胃癌细胞体内转移能力小鼠腹腔转移模型显示,过表达ZYX的XN0422细胞所形成的腹腔转移灶显著多于对照细胞(p=0.0003),而敲低ZYX的MGC803细胞所形成的腹腔转移灶显著少于对照细胞(p<0.0001)。3.ZYX激活WNK1/Snail通路诱导胃癌细胞EMT的发生(1)磷酸激酶抗体芯片筛选ZYX的下游磷酸激酶以磷酸激酶抗体芯片分析ZYX的下游磷酸激酶,发现过表达ZYX引起XN0422细胞中8种磷酸激酶磷酸化水平上调,其中上调最显著的是WNK1,提示WNK1可能是受ZYX调控的主要下游磷酸激酶分子。这一结果在过表达ZYX的XN0422细胞和敲低ZYX的MGC803细胞中得到WB实验验证。(2)敲低WNK1和WNK1抑制剂显著抑制ZYX的促进胃癌细胞侵袭作用在过表达ZYX的XN0422细胞中使用小干扰RNA(siRNA)敲低WNK1或使用WNK1抑制剂(WNK463)处理后,与对照组相比较其体外侵袭能力显著降低。(3)ZYX激活WNK1/Snail信号通路诱导胃癌EMT的发生过表达ZYX引起XN0422细胞中Snail和N-Cadherin的上调表达以及E-Cadherin的下调表达,而敲低ZYX导致MGC803细胞中Snail和N-Cadherin的下调表达以及E-Cadherin的上调表达。文献报道WNK1能调控Snail的表达。这些结果提示,ZYX可能通过激活WNK1/Snail信号通路诱导胃癌细胞发生EMT,从而促进胃癌细胞的迁移,侵袭和转移。4.ZYX在促进胶质瘤细胞体外迁移、侵袭的作用初探此外,初步实验表明,ZYX具有促进胶质瘤细胞体外迁移、侵袭的作用,为进一步深入研究ZYX在胶质瘤中的作用奠定了基础。结论:1.胃癌组织高表达ZYX,其表达水平与肿瘤大小、T分期、N分期、TNM分期显著正相关,而与胃癌患者总生存期和无进展生存期呈负相关,是胃癌患者的一个独立预后因子;2.ZYX促进胃癌细胞的迁移、侵袭和转移能力;3.ZYX通过激活WNK1/Snail信号通路诱导EMT而促进胃癌细胞的迁移,侵袭和转移。