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研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)作为一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以渐进性认知能力损害和记忆功能障碍为主要表现。其两大典型的病理学改变为:神经细胞间聚集的大量老年斑(senile plaques,SP)和神经细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。SP主要由淀粉样多肽-β(amyloid-β,A β)构成,而NFT的核心成分是由异常过度磷酸化的tau蛋白构成。已有研究证明,A β具有神经毒素作用,可以造成神经系统中多种细胞的功能失调和慢性炎症,是介导神经炎症的重要介质。同时有研究表明Aβ在视网膜中同样存在。且在某些年龄相关性眼底疾病当中,如年龄相关性黄斑变性,已经证明其也是炎症相关性疾病,其疾病的发生发展与视网膜炎症微环境紊乱有重要关系,但具体导致炎症的机制及Aβ在其中的作用并没有得到明确的阐述。研究目的:1.检测AD模型鼠眼底巨噬细胞M1型/M2型的表达量及在视网膜与脉络膜中的分布特点,探索视网膜炎症微环境的改变;2.检测AD模型鼠眼底Aβ的表达量与分布特点,及与模型鼠年龄的关系,探索Aβ的存在与视网膜炎症微环境改变的联系;3.检测A β对RPE细胞的影响,并进一步探索RPE细胞中mmp-9的表达量的改变会对M1型/M2型巨噬细胞的募集产生影响;4.探索一种新的通过观察眼底改变来了解AD病情的方法—OCT。研究方法:1.本课题选用转基因APP/PS1小鼠作为AD模型鼠,设置9月、12月、15月实验组,以同月龄野生型小鼠为空白对照,利用免疫组织荧光染色法检测不同周龄AD鼠眼底巨噬细胞M1型/M2型的表达数量及分布特点,分析视网膜炎症微环境的改变及年龄相关性。2.利用光学相干断层扫描技术(optical coherence tomography,OCT)及免疫组织荧光染色法对A β在眼底的表达进行活体及体外观察,并分析与巨噬细胞募集、趋向性分布的相关性。3.分离视网膜-脉络膜复合体提取蛋白质及RNA利用western blot及PCR技术检测INOS(M1型)、CD163(M2型)、Aβ及MMP-9的表达。4.利用Aβ1-42分别与人和鼠的RPE细胞共培养构建细胞模型,验证细胞的生物学功能改变及mmp-9表达量改变。5.RPE细胞模型与巨噬细胞共培养,验证巨噬细胞的分型特点及迁移、侵袭改变。同时通过siRNA下调mmp-9表达后观察巨噬细胞改变。6.利用无创的OCT技术可以观察视网膜各层Aβ斑块的积聚情况。实验结果:AD模型鼠眼底出现巨噬细胞浸润明显比同周龄小鼠早,且在视网膜中主要是M1型巨噬细胞,M2型多分布在脉络膜,说明AD模型鼠早于正常鼠眼底炎症微环境发生改变。同时,在视网膜各层均有发现Aβ的表达和视网膜-脉络膜复合体中mmp-9的升高。利用A β 1-42刺激的RPE细胞模型与巨噬细胞共培养,发现A β 1-42在加速RPE细胞衰老的同时,可以快速诱导巨噬细胞向M1型方向分化。下调其mmp-9表达后,M1型巨噬细胞分化减少,巨噬细胞整体活跃性降低,眼底炎症减弱,但并不能使炎症完全消失。同时,利用OCT技术发现,Aβ斑块可以出现在视网膜各个分层,呈高亮斑点状,并利用组织免疫荧光染色得以验证。结论:与阿尔茨海默病相关的Aβ可存在于视网膜各层组织中,能够促进视网膜色素上皮细胞中mmp-9的高表达。升高的mmp-9及A β直接/间接的诱导了巨噬细胞的募集并向M1型方向分化,改变视网膜炎症微环境稳态,为眼底年龄相关性疾病的发生创造条件。抑制mmp-9的高表达,将有效改善视网膜炎症微环境,降低阿尔茨海默病患者眼底疾病的发生率,大大提高患者视觉质量。另外,利用OCT技术可以观察到出现在视网膜各层的Aβ高亮斑块,为AD的早期诊断及病情追踪做出了初步研究。