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目的RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）分子引发的广泛存在于生物体中的序列特异性靶基因mRNA降解而导致的基因转录后沉默现象。本课题通过构建介导RNAi的质粒和慢病毒载体，研究载体介导RNAi的效果及在肿瘤细胞中对基因表达的抑制作用，为基因治疗提供新的手段。方法 应用分子克隆技术，构建针对GFP基因不同序列片段的以H1 RNA为启动子的RNAi质粒pLasRiGFP1/2/3和以U6为启动子的RNAi质粒pU6RiGFP1/2。用钙磷沉淀法将各种RNAi质粒与pcdna3.1EGFP共转染HEK293和Hela细胞，用脂质体法共转染SPCA1和GFP表达阳性的SPCA1-GFP细胞，用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP的表达情况。分析单质粒和组合质粒RNAi的作用效果。将pLasRiGFP1/2/3中的shRNA表达片段克隆入慢病毒转移质粒中构建plentiRiGFP1/2/3，与pcdna3.1EGFP共转染Hela和SPCA1细胞，观察分析其介导RNAi的作用，选择RNAi作用显著的plentiRiGFP1与pCMVΔR8.2和pCMVVSVG共转染HEK293T细胞包装产生介导RNAi作用的慢病毒载体LentiRiGFP1；同时包装产生表达GFP的慢病毒LentiGFP及对照慢病毒Lenti，用QRT-PCR测定慢病毒载体滴度；以LentiGFP转导SPCA1细胞，优化慢病毒体外转导肿瘤细胞的条件，用LentiRiGFP1转导SPCA1-GFP细胞，观察分析慢病毒载体介导RNAi的作用效果。结果1. pLasRiGFP1/2/3与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞，对GFP表达的抑制率分别为：97.5%/97%/89%、83%/90%/90%和65%/55%/40%；pU6RiGFP1/2与pcdna3.1EGFP共转染HEK293和Hela细胞，其抑制率分别为：47%/65%、60%/37%。 <WP=6>2. pLasRiGFP1/2/3与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞，对GFP基因表达的抑制在48h～96h间最强；并且随RNAi质粒增加RNAi作用效果逐渐增强，到达一定的剂量后，作用逐渐减弱。3.不同RNAi质粒的组合pLasRiGFP1+2/1+3/2+3/1+2+3在HEK293、Hela细胞中对GFP表达抑制率分别为：97.5%/96.5%/98.5%/99%，93%/82%/80%/88%。4.pLasRiGFP1/2转染SPCA1-GFP细胞，对GFP的抑制率分别为53% 、58%，随pLasRiGFP1剂量增加抑制作用增强，但到达一定的量后抑制作用趋于稳定。5.plentiRiGFP1/2/3与pcdna3.1EGFP共转染Hela和SPCA1细胞，对GFP的抑制率分别为：60%/60%/20%，58%/65%/70%。 6.以不同MOI的LentiRiGFP1转导SPCA1-GFP细胞后，对GFP的抑制率随着MOI的增加而增强，MOI为5后渐趋平缓，抑制率达80%；RNAi的作用持续15天。结论以H1RNA为启动子的RNAi质粒能有效抑制肿瘤细胞基因的表达，并存在剂量和时间依赖性；组合质粒与单质粒介导的RNAi作用效果存在差异，但无显著意义；作用于不同mRNA序列的RNAi 质粒载体对基因的抑制效果不同；RNAi作用存在细胞类型差异；H1RNA为启动子的RNAi质粒作用优于U6为启动子的RNAi质粒；介导RNAi作用的慢病毒载体能长期稳定抑制基因的表达。