论文部分内容阅读
第一部分 原发性高血压患者免疫微环境特征的研究背景:原发性高血压是一种轻度慢性炎症性疾病,然而,临床高血压的外周免疫状况仍缺乏全面的描述。我们希望通过对高血压患者外周血免疫细胞状态的研究,来阐明高血压独特的免疫微环境,期待为高血压的诊断和治疗提供帮助。方法:使用飞行时间质谱流式（CyTOF）技术对原发性高血压患者组（EH,n=5）和健康对照组（HC,n=5）的外周血单个核细胞（PBMC）进行检测。实验中使用42种金属偶联的抗体标记物来检测免疫细胞的表面与核内抗原,检测免疫细胞的数量和抗原表达强度。用x-shift聚类算法来处理数据,通过T-SNE数据可视化的方法对数据进行降维处理,得到二维viSNE图谱和热图,以此来分析高血压的免疫状态。结果:EH和HC受试者的PBMCs被聚类为32个细胞亚群。与健康对照组相比,原发性高血压组PBMCs亚型的频率1和抗原表达强度发生了改变。EH组的树突状细胞（DCs）频率明显升高（EH:3.54%,HC:1.67%;P=0.008）,低密度中性粒细胞（LDNs）频率显著降低（EH:0.08%,HC:1.28%;P=0.001）。两组之间的单核细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和B细胞各自的细胞总数量没有显著差异（单核细胞:P=0.25,NK细胞:P=0.64,CD4+T细胞:P=0.64,CD8+T细胞:P=0.93,γδ T细胞:P=0.35,B细胞:P=0.50）。上述各大类免疫细胞中部分亚群频率发生改变。高血压患者的2个髓样树突状细胞（mDC）亚群,CX3CR1+CD38-CD1 1c+HLA-DR+DCs 和 CCR5+Ki-67+CD1 1c+HLA-DR+CD123-DCs 频率均显著增加（P＜0.05,P＜0.01）。高血压患者的 CD45hi CXCR3+CX3CR1+HLA-DRhi CD11blow CD16+CD14low单核细胞亚群的比例增加,这个亚群与中间型和非典型单核细胞的特征相同（P＜0.01）。反之,在高血压组5个CD45lowCXCR3-CD16-/low单核细胞亚群的细胞频率显著降低,甚至几乎消失。高血压组中CD45RO-CCR7+CD95-naive CD4+T 细胞、CD45RO+CCR7-CD27-CD28+CD4+效应记忆 T 细胞,CD45low CD45RO+CCR7+CD27+CD28+CD4+中央记忆T细胞亚群的频率均显著降低（P＜0.0001,P＜0.01,P＜0.01）,而 CD45hiCD45RO+CCR7+CD27+CD28+CD4+中央记忆T细胞亚群频率显著升高（P＜0.001）。高血压组的CD45RO-CCR7+CD95-naive CD8+T 细胞和 CD45low CD45ROlow CD161+ CCR7-CCR5+CCR6low CD8+效应记忆T细胞亚群频率均下降,而CD45hi CD45RO+CD161+CCR7-CCR6+CCR5+CD31+ CD8+效应记忆T细胞亚群频率上升（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05）。此外,高血压组 CD45RO+CCR7-CD57+CD38+PD-1+HLA-DR+CD8+效应记忆 T 细胞亚群的频率升高（P＜0.05）。在所有CD45+免疫细胞中,EH组的CD45、CD95、CD45RO、CCR5、Ki-67、TLR4、CXCR3、CTLA4、Foxp3、CD24、CD38、ICOS、CD69、PD-1的表达量均显著增加,而CD11b的表达量显著减少。此外,与健康对照组比较,EH组中一些特征性marker的表达在特定类型免疫细胞中显著增强,例如单核细胞、粒细胞和B细胞。结论:在高血压患者的外周血中,总的DCs和mDCs数量显著增加,反映出树突状细胞与高血压的相关性和重要作用。高血压中LDNs的绝大多数抗原活性增强,促炎症型单核细胞亚群的频率增加,而经典型单核细胞的数量减少,这些可能都和高血压的进程有关。在高血压中,T细胞被异常激活,naive T细胞和记忆T细胞之间存在不平衡。总之,原发性高血压患者外周血树突状细胞、单核细胞、粒细胞、NKs、T细胞和B细胞数量和抗原表达的改变反映了外周血免疫微环境的失稳态。第二部分 外泌体对内皮功能和SHR微循环的作用和机制探讨目的:研究炎症细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α和外泌体对高血压发展中的内皮功能的影响。同时确定正常内皮细胞来源的外泌体对自发性高血压大鼠（SHRs）皮肤微循环状况的影响。方法:从HUVECs的条件培养基中分离出内皮细胞来源的外泌体,TExo是用20ng/mL TNF-α处理后得到的外泌体,CExo是不做任何处理得到的外泌体。在用或不用20 ng/mL TNF-α 或 10 μg/mL CExo或 10 μg/mL TExo处理后的 0 h、3 h 和 6 h,动态监测HUVECs的成管作用。检测了 HUVECs的条件培养基中的血管生成相关蛋白。测定了内皮细胞或线粒体中的活性氧（ROS）水平。通过Western blot检测了与炎症和ROS有关的多种信号蛋白。使用激光多普勒血流成像仪和激光多普勒灌注和温度监测仪监测SHRs和对照WKY大鼠（Wistar-Kyoto rats）（8周龄）的皮肤微循环状况。对多普勒信号进行小波变换和分析来确定其频谱的来源。结果:与对照组细胞相比,TNF-α、CExo和TExo处理6h可明显促进内皮小管的形成（P＜0.05或P＜0.01）;在以TNF-α、CExo或TExo处理的HUVECs的条件培养基中发现了更高的 ENA-78、Leptin、TIMP-1、Endostatin、IL-2、IL-4、ANGPT1、MCP-3、GM-CSF、TNF-α等分子水平;以TNF-α CExo或TExo处理后,总ROS和mtROS的水平都明显增加（P＜0.01或P＜0.05）。TNF-α明显增加了 STAT3、p38、JNK、Akt的磷酸化和内皮细胞中NF-κB的水平（均为P＜0.01）。CExo明显增加了 STAT3的磷酸化水平,并降低了 JNK和Erk的磷酸化水平（均为P＜0.01）。TExo显著提高了磷酸化STAT3、p38和NF-κB的水平,并降低了 JNK和Erk的磷酸化水平（P＜0.01或 P＜0.05）。与WKY大鼠相比,SHRs的耳皮肤血管灌注明显不足（P＜0.01）。给予SHRs尾静脉注射CExo后的10 min、6h和24 h,其血液灌注量显著增加（均为P＜0.01）;与WKY大鼠相比,SHRs内皮频谱的平均振幅明显低下（P＜0.01）。而给予SHRs注射CEx。后6 h和24 h内,其内皮频谱的平均振幅显著增加（均为P＜0.01）。结论:增加的ROS和炎症信号在高血压的发展中参与了外泌体介导的内皮功能和行为改变。CExo通过内皮依赖的方式增加了 SHRs的皮肤微血管灌注。