论文部分内容阅读
目的:免疫球蛋白A肾病（Immunoglobulin A nephropathy,IgAN）被认为是目前最常见的原发性肾小球肾炎,然而其发病机制仍然不明确。近年来,长链非编码RNAs（Long noncoding RNAs,lncRNAs）被发现与多种疾病的发生发展有关,包括肾脏疾病。首先,本研究对已经公开的IgAN转录组数据（GSE154046）进行分析,鉴定该转录组数据中IgAN差异表达的lncRNAs（differentially expressed lncRNAs,DElncRNAs）。然后,本研究再通过临床样本进一步验证上述分析结果,深入揭示lncRNAs在IgAN的发生发展中发挥的作用。方法:1.从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载IgAN公共转录组数据（GSE154046）并进行数据分析,包括3例IgAN患者和3例健康人外周血单核细胞转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）数据。1)GSE154046 RNA-seq原始数据中包含一些测序质量较低的序列,为了保证数据分析的质量及可靠性,应用FASTX-Toolkit软件对数据进行过滤。使用tophat2对过滤后的数据进行基因组比对,并计算RPKM值分析基因的表达水平,使用edge R软件进行差异基因分析,根据错误发现率及折叠变化确定差异表达基因,鉴定出该转录组数据中在IgAN组与健康对照组之间的DElncRNAs和差异表达m RNAs（differentially expressed Messenger RNAs,DEm RNAs）。分别利用RPKM、TPM值进行样本间表达水平比较、主成分分析和绘制DElncRNAs及DEm RNAs的热图。2)应用加权基因共表达网络分析,并计算DElncRNAs及DEm RNAs之间的皮尔逊相关系数,获得IgAN样本中与DElncRNAs共表达的DEm RNAs,并构建DElncRNAs与其共表达的DEm RNAs网络图。3)提取DElncRNAs上下游10kb范围内的基因信息,同时计算DElncRNAs和m RNAs之间的皮尔森相关系数进行共表达分析,筛选满足相关系数绝对值大于0.6且p值＜0.05的lncRNA-靶标m RNA关系对,再对这两个数据集取并集,鉴定出IgAN样本中的DElncRNAs以及它可能顺式调控的靶标m RNAs。2.在临床样本中验证GSE154046 RNA-seq数据分析结果。1)入选2021年11月1日至2022年1月31日在我院住院的患者6例,并选择健康对照6例。2)采集IgAN患者及健康对照的外周血,进行淋巴细胞分离,获得外周血单核细胞后提取RNA,实时定量聚合酶链反应进行相关检测。3)收集临床检验指标（尿红细胞计数、尿蛋白定量、血肌酐）。4)所有实验数据结果均采用均数±标准差表示,通过使用统计软件IBM SPSS Statistics 26进行t检验,P＜0.05视为差异具有统计学意义。结果:1.鉴定出855个DElncRNAs,其中差异下调表达的lncRNAs（709个）显著高于差异上调表达的lncRNAs数量（146个）,根据DElncRNAs的表达特点,可以明显将疾病组与健康组样本区分开。2.分析出IgAN患者中DElncRNAs共表达的m RNAs,这些基因的功能在免疫相关的通路中富集,暗示这些DElncRNAs可能参与IgAN发病过程中的免疫反应。3.本研究获得IgAN中DElncRNAs顺式作用的m RNAs,其中多个基因富集到免疫或炎症相关的通路,这些lncRNA-m RNA对包括RP11-16C1.2—GRB2、RP11-298C2.1—FOXP1、RP11-815J21.1—AKAP13、RP11-115H15.2—MED13L、RP11-403H13.1—KDM4C。4.本研究发现在鉴定的5对DElncRNA-靶标m RNA（RP11-16C1.2—GRB2、RP11-298C2.1—FOXP1、RP11-815J21.1—AKAP13、RP11-115H15.2—MED13L、RP11-403H13.1—KDM4C）中,RP11-298C2.1、RP11-815J21.1、RP11-16C1.2、RP11-115H15.2在IgAN中差异下调,KDM4C基因在IgAN中差异上调,与RAN-seq结果一致;RP11-403H13.1在IgAN中差异上调,AKAP13、MED13L基因在IgAN中差异下调,与RAN-seq结果相反;GRB2、FOXP1基因在疾病组与健康对照组表达无明显差异。结论:IgAN中存在大量差异下调的lncRNAs,DElncRNAs参与IgAN过程中免疫和炎症相关基因的调控,在IgAN发病过程中发挥重要功能,并可作为潜在的分子标记物,为IgAN的临床诊断标准和治疗方案提供新的研究思路和方向。