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背景和目的:中性粒细胞自噬、凋亡和中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)的形成可能参与系统性红斑狼疮(Systemic Lupus erythematosus,SLE)的病理过程。中性粒细胞在发生自噬的过程中,可能影响凋亡和胞外诱捕网的产生。本研究分析了 SLE患者外周血中性粒细胞自噬、凋亡和NETs水平与健康对照者的差异以及自噬与后两者的相关性,并探究不同自噬诱导剂作用下中性粒细胞凋亡和NETs形成水平变化,以期揭示SLE患者外周血中性粒细胞自噬对凋亡和NETs生成的影响。材料与方法:1.SLE患者中性粒细胞自噬、凋亡和NETs水平及其相关性分析1.1收集2019.09-2020.08川北医学院附属医院风湿免疫科36例女性SLE患者作为研究对象,并收集其临床资料和相关实验室数据。以同期体检的32例女性健康体检者(Healthy control,HC)作为健康对照组。1.2流式细胞术和Western blot检测SLE患者和健康对照组中性粒细胞中自噬分子LC3B、Atg5、p62和凋亡分子Bcl-2、BAX表达水平,ELISA检测血浆中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)浓度反映NETs形成水平。分析患者组与对照组之间的差异,以及自噬分子与凋亡分子或MPO之间的相关性。2.体外诱导中性粒细胞自噬对凋亡和NETs的影响收集12例川北医学院附属医院体检中心女性健康体检者外周血15mL,EDTA抗凝,分离中性粒细胞。用雷帕霉素终浓度100nM、LPS终浓度10μg/mL体外处理中性粒细胞6h,Western blot检测自噬分子LC3B、Atg5、p62和凋亡分子Bcl-2、BAX表达水平;ELISA检测培养上清液中MPO蛋白表达水平;荧光光度法(SytoxTM Green染色)检测中性粒细胞释放的NETs水平。分析不同自噬诱导剂处理中性粒细胞后凋亡和NETs形成水平变化,以明确自噬参与凋亡或NETs形成的可能机制。3.采用GraphPad Prism8进行数据统计与分析,偏态分布数据使用中位数(四分位间距)[M(QR)]表示,正态分布数据使用均数±标准差(x±s)表示,组间两两比较采用t检验,相关性分析采用Spearman,以p<0.05定义为有统计学意义。结果:1.SLE患者中性粒细胞自噬、凋亡和NETs水平及其相关性分析1.1 SLE患者中性粒细胞自噬和凋亡相关性分析与健康对照组比较,SLE组自噬蛋白LC3B-Ⅱ和Atg5表达水平显著增高,p62表达水平明显降低(p<0.05);SLE组LC3B平均荧光强度也显著增加(p<0.05)。表明SLE患者中性粒细胞自噬水平异常增高。SLE组抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(p<0.05),促凋亡蛋白BAX表达无显著差异(p>0.05),Bcl-2/BAX比值显著降低,表明SLE患者中性粒细胞凋亡水平显著增高。SLE组自噬分子LC3B-Ⅱ、Atg5与抗凋亡蛋白Bcl-2 负相关(r=-0.56 和r=-0.65,p<0.001),p62 与 Bcl-2 正相关(r=0.67,p=0.0016),说明SLE患者外周血中性粒细胞自噬与凋亡正相关。1.2 SLE患者中NETs形成水平与中性粒细胞自噬相关性分析与健康对照组比较,SLE组血浆中MPO蛋白表达水平显著增高(p<0.05),表明SLE患者中性粒细胞自发释放NETs异常增多。SLE组中MPO蛋白表达水平与自噬分子Atg5正相关(r=0.62,p=0.003),与p62负相关(r=-0.45,p=0.041),与LC3B-Ⅱ无明显相关性(r=0.36,p=0.113),说明SLE患者体内外周血中性粒细胞自噬与NETs形成协同增加,并可能受Atg5和p62调控。2.体外诱导中性粒细胞自噬对凋亡和NETs的影响2.1雷帕霉素诱导中性粒细胞自噬对凋亡的影响与空白对照比较,雷帕霉素处理的中性粒细胞中自噬分子LC3B-Ⅱ表达明显增高,p62表达显著降低(p<0.05);然而抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白BAX表达均无显著差异(p>0.05);雷帕霉素组中自噬分子LC3B-Ⅱ、p62与抗凋亡蛋白Bcl-2均无相关性(r=0.56和r=-0.25,p>0.05)。2.2雷帕霉素诱导中性粒细胞自噬对NETs形成的影响与空白对照比较,雷帕霉素处理的中性粒细胞释放NETs平均荧光强度无明显差异,其培养上清中MPO表达水平无显著差异(p>0.05);MPO蛋白与自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、p62均无相关性(r=-0.34和r=0.13,p>0.05)。2.3 LPS诱导中性粒细胞自噬对凋亡的影响与空白对照相比,LPS处理的中性粒细胞中自噬分子LC3B-Ⅱ和Atg5表达均显著增高(p<0.01),p62表达显著减低(p<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平和促凋亡蛋白BAX表达水平均无差异变化(p>0.05)。LPS处理的PMNs中自噬分子LC3B-Ⅱ、Atg5和p62与抗凋亡蛋白均无相关性(r1=0.16,r2=0.64 和 r3=-0.32,p>0.05)。2.4 LPS诱导中性粒细胞自噬对NETs形成的影响与空白对照比较,LPS处理的中性粒细胞释放NETs平均荧光强度明显增加,培养上清中MPO蛋白浓度也显著增高(p<0.05)。自噬分子Atg5 与 MPO 正相关(r=0.83,p=0.042),p62 与 MPO 负相关(r=-0.82,p=0.0435),LC3B-Ⅱ与 MPO 无明显相关性(r=0.74,p=0.09)。结论:1.SLE患者外周血中性粒细胞自噬、凋亡和NETs水平异常增高,中性粒细胞自噬分别与凋亡和NETs水平正相关。2.雷帕霉素诱导中性粒细胞自噬增加,但对凋亡和NETs形成无明显影响;LPS诱导中性粒细胞自噬增加,可加速NETs形成,但对凋亡无显著诱导作用。