【摘 要】
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蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)是生物体内一种多功能酶,主要存在于内质网中,可担任氧化还原酶、异构酶、分子伴侣等,对蛋白质的正确折叠起着重要的作用。近年来发现PDI不仅存在于细胞内,在某些情况下还会分泌到胞外,调节细胞表面多种蛋白质的活性,影响凝血、损伤反应和血小板活化等多种生物学过程,在血栓形成的过程中发挥着重要作用。PDI通过调节血小板活化和
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蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)是生物体内一种多功能酶,主要存在于内质网中,可担任氧化还原酶、异构酶、分子伴侣等,对蛋白质的正确折叠起着重要的作用。近年来发现PDI不仅存在于细胞内,在某些情况下还会分泌到胞外,调节细胞表面多种蛋白质的活性,影响凝血、损伤反应和血小板活化等多种生物学过程,在血栓形成的过程中发挥着重要作用。PDI通过调节血小板活化和凝血系统激活而调控血栓的形成,故而PDI作为一种新型抗血栓治疗的靶点受到越来越多的关注。本论文中,我们基于PDI的结构进行虚拟筛选,得到了49种针对PDI底物结合结构域的可逆抑制剂。基于荧光的结合实验及胰岛素还原实验,进一步确定了其中6种抑制剂可以有效地抑制PDI活性。其中的小分子高良姜素(galangin)与PDI的分子对接及分子动力学模拟结果表明,galangin主要与其周围疏水性氨基酸形成疏水相互作用,并与PDI b’结构域的H256形成氢键,可逆结合在PDI底物结合口袋。同时,galangin的小鼠体内抗血栓评价表明,galangin能明显延长小鼠血栓形成时间,且具有较好的安全性。PDI能调控蛋白质折叠,但其与底物蛋白相互作用的分子机制并不清楚。为了研究PDI调控底物折叠的分子机制,我们设计了两个PDI活性位点的突变体PDI-C56S和PDI-C400S。通过优化这两种突变体蛋白与底物结合的条件,在37℃、p H 8.5的条件下,最大程度地获得了突变体PDI-C56S与底物SUMO-KD1的稳定复合物。通过结晶条件筛选,得到了复合物的初步晶体。针对PDI的氧化还原酶特性及分子伴侣功能,我们将原核表达系统进行了改造。将PDI和巯基氧化酶Erv1p基因导入原核表达系统,利用这些酶的共表达,使富二硫键蛋白质在原核表达体系中表达为具生物学活性的可溶性蛋白质。运用此改造系统,我们成功获得了有活性的含多对二硫键的蛋白酶类抑制剂。综上,本文基于PDI的结构筛选到了6种PDI可逆性抑制剂,为今后抗血栓药物的开发提供了参考;得到PDI突变体蛋白PDI-C56S与底物SUMO-KD1复合物的初步晶体,为PDI调控底物折叠的分子机理研究奠定了基础;将PDI应用于大肠杆菌表达系统,促进富二硫键蛋白质的正确折叠及可溶性表达,为外源蛋白的表达提供了更多的选择。
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