【摘 要】
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作为第一个被报道的抑制基因,RB1突变失活或其蛋白p Rb磷酸化失活与多种癌症的发生和进展密切相关,寻找和鉴定针对RB1缺失相关肿瘤的抑制靶标具有重要的理论和临床价值。TAZ蛋白作为Hippo通路中重要的转录辅激活因子,参与细胞增殖、分化以及凋亡等过程,并且在肿瘤的发展过程中也发挥着重要作用。p Rb-E2F通路与Hippo通路的关联性研究在果蝇发育中被报道,然而在肿瘤细胞的增殖过程中二者是否存在
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作为第一个被报道的抑制基因,RB1突变失活或其蛋白p Rb磷酸化失活与多种癌症的发生和进展密切相关,寻找和鉴定针对RB1缺失相关肿瘤的抑制靶标具有重要的理论和临床价值。TAZ蛋白作为Hippo通路中重要的转录辅激活因子,参与细胞增殖、分化以及凋亡等过程,并且在肿瘤的发展过程中也发挥着重要作用。p Rb-E2F通路与Hippo通路的关联性研究在果蝇发育中被报道,然而在肿瘤细胞的增殖过程中二者是否存在互作尚未被证实。本课题旨在阐明作为Hippo通路重要的辅激活因子TAZ在RB1缺失肿瘤增殖过程中所起的功能与分子机制,为RB1缺失肿瘤的治疗提供潜在的抑制靶标。主要研究成果如下:（1）体外、体内模型构建。构建靶向TAZ慢病毒质粒sh TAZ和对照质粒sh-TRC,并成功包装慢病毒,用于分别感染前列腺癌细胞系DU145RB1mut和PC3RB1wt,以及原代小鼠成纤维细胞MEFRb1-/-和MEFRb1+/+,获得功能研究的体外细胞模型。利用Cre-lox P条件性敲除系统,通过小鼠杂交获得Rb1 WT、Rb1 KO和Rb1;Taz DKO三种脑垂体条件性敲除小鼠,作为体内验证模型。（2）体外功能研究与表型。通过zen Cell和RTCA对不同处理组细胞的生长增殖进行监测,结合平板集落形成实验,证实靶向TAZ基因能够显著抑制RB1缺失细胞的生长增殖。通过流式细胞术细胞周期分析与基于Brd U掺入的细胞免疫荧光实验进一步显示,TAZ是通过阻滞细胞周期G1/S期转换,进而抑制RB1缺失细胞生长增殖。TAZ在RB1野生型细胞中并不能引起相关表型变化。（3）互作机制研究。通过Western Blot、RT-q PCR、基于荧光素酶报告系统的启动子转录分析和免疫共沉淀（Co IP）等机制实验,我们揭示了在RB1缺失时,TAZ可作为转录辅激活因子,参与转录因子E2F1对其靶基因的转录上调,进而促进细胞周期G1/S期转换和细胞过度增殖。靶向抑制TAZ,显著削弱这一转录激活过程,从而使RB1缺失的细胞生长增殖受到抑制。（4）体内模型验证。采用条件性敲除技术,构建Rb1 KO小鼠脑垂体瘤模型,进一步通过与Taz KO小鼠杂交获得Rb1/Taz DKO小鼠。通过比对7、10、14周龄Rb1KO与Rb1/Taz DKO小鼠脑垂体组织的病理切片,我们发现敲除Taz能显著抑制Rb1缺失引起的脑垂体肿瘤发生。（5）药物联用协同增效。靶向抑制p Rb磷酸化的抑制剂Abemaciclib容易伴随RB1基因突变而产生耐药性,为解决这一临床问题,我们以DU145RB1mut为细胞模型,探究Abemaciclib与TAZ抑制剂Verteporfin联用达到协同增效的潜在临床价值。我们发现,相较于Abemaciclib单用,Abemaciclib与Verteporfin联用能够显著提高对DU145RB1mut细胞增殖的抑制,显著抑制肿瘤细胞G1期到S期的转换;进一步的机制研究显示,联用处理组通过抑制E2F靶基因的表达,导致DNA合成被抑制引起G1/S期阻滞,该结果也进一步印证了体外和体内模型中的研究结果。本研究发现了靶向抑制TAZ,显著抑制RB1缺失细胞的生长增殖,及Rb1缺失引起的肿瘤发生。机制研究显示,RB1缺失时,TAZ作为转录辅激活子促进E2F1对其靶基因的转录上调,进而促进DNA合成和细胞周期G1/S期转换。我们进一步揭示,靶向TAZ的小分子抑制剂Verteporfin与Abemaciclib联用,针对RB1缺失的DU145细胞具有协同增效的作用。本课题的研究结果阐明了p Rb-E2F通路和Hippo通路相互作用的分子机制,为后续的进一步研究提供了理论依据,也为临床上RB1缺失肿瘤的治疗以及肿瘤临床治疗中产生的Abemaciclib耐药性问题的解决提供了新的思路。
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