【摘 要】
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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种恶性程度高,易复发,预后极差的肿瘤,约占原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）的75%-85%。外科手术切除仍然是HCC首选的最有效的根治性治疗方法,但早期难以发现,症状往往在晚期才被发现,手术切除率低。早诊早治、预防、肿瘤靶向和免疫治疗是降低肿瘤死亡率的重要原因。HCC的治疗模式正在逐渐向靶向免疫治
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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种恶性程度高,易复发,预后极差的肿瘤,约占原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）的75%-85%。外科手术切除仍然是HCC首选的最有效的根治性治疗方法,但早期难以发现,症状往往在晚期才被发现,手术切除率低。早诊早治、预防、肿瘤靶向和免疫治疗是降低肿瘤死亡率的重要原因。HCC的治疗模式正在逐渐向靶向免疫治疗方向发展,然而它在临床试验中的治疗效果却不令人满意,最新研究表明这与HCC免疫微环境的形成有关。目前国内外许多研究表明肿瘤来源外泌体中程序性死亡配体-1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）在肿瘤免疫微环境中抑制T细胞的活性,导致免疫疗法的治疗反应率降低,而HCC外泌体中PD-L1在肿瘤免疫微环境中的功能和作用却鲜有报道。目的 通过研究外泌体中PD-L1在HCC患者和健康志愿者外周血中表达水平,分析其与HCC患者临床病理的关系,并进一步研究外泌体中PD-L1对CD8+T细胞的影响,探究其在HCC肿瘤微环境中的作用机制,以期寻找更有效的针对HCC的免疫治疗方法。方法 1、抽取HCC患者和健康志愿者外周血,分离人外周血外泌体,采用酶联免疫技术检测患者和健康志愿者外周血外泌体中PD-L1蛋白的表达水平。通过收集临床病理信息,分析患者外周血外泌体中PD-L1的表达水平与HCC患者临床病理特征及预后的关系。2、采用免疫组化染色技术,研究肿瘤组织中PD-L1与CD8抗原的关系。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒示踪分析（NTA）和蛋白免疫印迹技术（Western blot）对外泌体特征进行鉴定。3、采用分子克隆技术构建PD-L1过表达及沉默质粒,再通过q RT-PCR和Western blot实验方法检验质粒表达效果。4、采用免疫磁珠分选的方法,体外分离人外周血CD8+T细胞,利用CCK-8试剂检测肝癌细胞系上清外泌体中PD-L1对CD8+T细胞活性的影响。5、构建C57BL/6J小黑鼠移植瘤模型,采用尾静脉注射的方式将提取的细胞上清外泌体注入小鼠体内,通过小鼠体内实验,探究外泌体中PD-L1对肿瘤生长的影响。结果 1、HCC患者外周血外泌体中PD-L1的表达量要高于健康志愿者。外泌体中PD-L1低表达的患者生存率要高于外泌体中PD-L1高表达的患者。外泌体中PD-L1的表达量与患者的肿瘤数目、血清甲胎蛋白和TNM分期等临床病理特征相关。2、病人组织切片中PD-L1抗原数目与CD8抗原数目成反比。蛋白免疫印迹实验成功检测到病人血清外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101和PD-L1蛋白,以及TEM拍照成像和NTA鉴定结果,表明外泌体被成功提取。3、细胞上清来源外泌体中PD-L1能抑制CD8+T细胞的活性。我们成功构建人源过表达PD-L1和sh PD-L1质粒,通过CCK-8实验发现转染过表达PD-L1和sh PD-L1质粒对Huh7细胞的生长没有显著影响,而过表达PD-L1质粒后提取的细胞上清外泌体显著抑制了CD8+T细胞的活性,sh PD-L1后提取的上清外泌体对CD8+T的抑制降低。4、鼠源肝癌细胞系来源的外泌体中PD-L1能促进移植瘤的生长。免疫组化实验结果显示移植瘤中PD-L1表达量与CD8抗原数目呈负相关。结论 1、外泌体中PD-L1在HCC患者和健康志愿者外周血中表达存在差异,外泌体中PD-L1的表达水平与患者临床病理特征和生存率相关。2、外泌体中PD-L1抑制肿瘤免疫微环境中CD8+T细胞的活性,促进肿瘤的生长。
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