【摘 要】
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目的:了解ISEcp1、ISEcp1-CTX-M在我国耐药志贺菌的分布,探讨ISEcp1通过间隔序列（Spacers）介导志贺菌耐头孢菌素的作用,为耐头孢菌素志贺菌的耐药机制研究和新型抗菌药物研制提供理论依据。方法:基于军队肠道病原体监测平台,收集2004-2016年国内14个不同省市志贺菌4342株,药物敏感性试验检测耐药性,描述ISEcp1、ISEcp1-CTX-M在耐药志贺菌的分布。按ISE
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目的:了解ISEcp1、ISEcp1-CTX-M在我国耐药志贺菌的分布,探讨ISEcp1通过间隔序列（Spacers）介导志贺菌耐头孢菌素的作用,为耐头孢菌素志贺菌的耐药机制研究和新型抗菌药物研制提供理论依据。方法:基于军队肠道病原体监测平台,收集2004-2016年国内14个不同省市志贺菌4342株,药物敏感性试验检测耐药性,描述ISEcp1、ISEcp1-CTX-M在耐药志贺菌的分布。按ISEcp1、Spacers和blaCTX-M的不同组合设计并合成目的基因片段,构建含有这些目的基因片段的重组克隆质粒,将其转染大肠杆菌进行外源表达,采用E-TEST法测定重组克隆株对头孢菌素的耐药表型,评价不同组合目的基因片段对重组克隆株的作用差异,蛋白质组学分析重组克隆株的耐药表型与其蛋白质表达的关系,推测调控blaCTX-M表达的重要转录因子和Spacers中与调控相关的碱基序列。结果:1.ISEcp1在耐头孢菌素志贺菌的携带率为90.09%,明显高于其它革兰氏阴性肠杆菌,ISEcp1-CTX-M元件在耐头孢菌素志贺菌的携带率为67.19%,ISEcp1携带率blaCTX-M-9基因群显著高于blaCTX-M-1基因群（P＜0.05）。2.相比于仅含blaCTX-M基因型的重组克隆株,ISEcp1-spacer-blaCTX-M重组克隆株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢噻吩、头孢吡肟的MIC显著提高,均表现出强耐药性;野生型Spacer取代固有Spacer之后,重组克隆株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢噻吩依然呈强耐药性,但对头孢吡肟的耐药性明显减弱,减弱程度随blaCTX-M亚型不同而不同;blaCTX-M各亚型搭配固有Spacer时,重组克隆株对头孢菌素耐药性最强。3.对不同blaCTX-M亚型ISEcp1-spacer-blaCTX-M元件中的Spacers（42bp、45bp、48bp、128bp）进行随机突变,药敏实验结果显示,DH5α（Δ42spacer SJ、Δ45spacer SJ）突变株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢噻吩、头孢吡肟的强耐药性变为敏感,DH5α（Δ48spacer SJ、Δ127spacer SJ）对头孢呋辛、头孢噻吩仍呈强耐药性,对头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟敏感。4.为筛选关键碱基,对各型别Spacers进行分段随机突变,药敏结果显示,Spacers中存在关键碱基,关键碱基突变后,突变株DH5α（Δ42spacer3-1、Δ48spacer3-2、Δ127spacer3-3、Δ45spacer3）对头孢曲松、头孢噻肟的耐药性显著降低。5.蛋白质组学分析结果显示,菌株DH5α（IS-42-CTX-M-14*）中的blaCTX-M-14蛋白的表达显著上调,与药敏实验结果相一致;筛选出的差异蛋白主要与原核生物DNA转录相关,转录因子RNA聚合酶σ因子和转录调节因子（Lrh A、evg A）的表达在DH5α（Δ42spacer SJ、IS-CTX-M-55）均显著下调（P＜0.05）。结论:1.通过对头孢耐药志贺菌进行元件ISEcp1、ISEcp1-CTX-M的筛检,结果显示,ISEcp1在耐头孢菌素志贺菌的携带率为90.09%,明显高于其它革兰氏阴性肠杆菌,ISEcp1-CTX-M元件在耐头孢菌素志贺菌的携带率为67.19%。2.Spacers存在ISEcp1对blaCTX-M调控作用的关键碱基,集中在Spacers末端,邻近blaCTX-M处。3.Spacers可增强ISEcp1对下游blaCTX-M基因的转录调控作用,42bp Spacer参与转录因子RNA聚合酶σ因子、转录调节因子（Lrh A、evg A）介导志贺菌对头孢菌素的强耐药性。
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