脓毒症是机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍,每年威胁全球数百万人的生命健康。现有的脓毒症治疗手段主要包括液体复苏,迅速有效的抗生素应用以及支持性治疗等。但由于脓毒症病理生理学的异质性和复杂性,迄今为止还没有针对脓毒症的具体疗法。正常机体的肠道菌群参与肠道免疫屏障的形成,预防肠道病原体定植和易位。然而,脓毒症时肠道菌群的组成可在数小时内发生变化,表现为微生物多样性丧失,病原微生物占据优势。有研究表明,肠道菌群组成的变化与肺部免疫反应和气道内稳态的改变有关,肠道菌群失调还能够增加脓毒症的易感性。代谢组学是对生物系统中参与各种生化反应的小分子代谢物进行定性和定量分析的技术。近年来不少研究运用代谢组学检测和分析脓毒症中血液和尿液中代谢物的变化和规律。这些研究分别从脓毒症的发病机制、早期诊断标志物的筛选、药物疗效等方面进行了代谢组学分析。这对脓毒症复杂的发病机制提供了理论支撑,且对脓毒症的个性化药物的开发与应用提供了可靠的依据。甲磺酸加贝酯（Gabexatemesilate,GM）是一种非肽类蛋白水解酶抑制剂,具有较强的抑制蛋白酶和纤维蛋白溶酶的作用。GM预处理脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）大鼠可显著减少血清炎症因子等指标的升高,减轻肺、肝、肾功能不全。本研究假设GM可能改变脓毒症肠道菌群及粪便代谢组学,并减轻脓毒症诱导的急性肺损伤。使用盲肠结扎穿刺（Cecal ligation and puncture,CLP）诱导脓毒症大鼠模型,比较假手术组（Sham control group,SC）,CLP组及GM给药组三组肠道菌群及代谢组学的变化趋势,分析差异菌群和差异代谢物的相关性,随后统计CLP术后24小时各组大鼠的死亡率,并观察各组肺脏的损伤情况,以探索GM对脓毒症大鼠肠道菌群和代谢组学的影响,以及GM在减轻脓毒症诱导的急性肺损伤中的潜力。第一部分 甲磺酸加贝酯对脓毒症大鼠肠道菌群的影响方法1.6-8周龄成年雄性SD大鼠随机分为SC组,CLP组,CLP术后1小时腹腔注射GM组。盲肠结扎穿刺模型的建立基于我们先前的研究报道。CLP术后24小时收集各组存活大鼠的结肠粪便。2.提取各组大鼠粪便样本DNA,进行16SrRNA高通量测序。将得到的有效数据以97%的一致性进行可操作分类单元（Operational taxonomic units,OTUs）聚类和物种分类分析。3.使用R软件进行α多样性和β多样性组间差异分析。使用Metastats分析对SC组、CLP组及GM组三组的菌群特征进行比较,使用LEfSe分析两个或多个组别,寻找组与组之间具有统计学差异的肠道菌群。另外,将组间差异菌群和Tax4Fun预测的菌群功能进行相关性分析。结果1.在SC组、CLP组、GM组分别鉴定了 660、616、850个OUTs,三组共有的OUTs是495个。SC组及GM组的优势菌门是厚壁菌（Firmicutes）,CLP组的优势菌门是变形菌（Proteobacteria）和疣菌群（Verrucomicrobiota）。且厚壁菌与变形菌的比例在CLP组中显著减少。SC组及GM组的优势菌属是乳酸杆菌（Lactobacillus）和瘤胃球菌（Ruminococcus）。CLP的优势菌属是贺氏菌（Escherichiashigella）,阿克曼氏菌（Akkermansia）。2.SC组和GM组的α多样性高于CLP组。β多样性PCoA分析显示SC组与GM组的样本倾向于聚集在一起,表明这两组物种组成结构相似,而与CLP组群落差异较大。3.CLP组与SC组的差异菌属有3种,分别是乳酸杆菌、Romboutsia及贺氏菌。CLP组与GM组的差异菌属有5种,分别是乳酸杆菌、脓杆菌（Pygmaiobacter）、白粉菌科UCG003（ErysipelotrichaceaeUCG003）、贺氏菌及阿克曼氏菌。SC组与GM组的差异菌属只有Parasutterella。4.将GM组和CLP组的菌属构建一个相互作用网络,相比于CLP组,GM组菌属之间的相关性更高。Tax4Fun分析显示18条通路（如细胞运动和分泌（Cell motility and secretion）,聚糖生物合成和代谢（Glycan biosynthesis and metabolism））等在CLP组和GM组之间差异富集。另外,差异菌群和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路的Spearman相关分析显示,变形杆菌（Proteus）、鼠杆菌（Muribaculum）、贺氏菌、阿克曼氏菌与转运（Transport）,卟啉与叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）,癌症途径（Pathways in cancer）等通路呈显著正相关。乳酸杆菌、白粉菌科UCG003与转运,卟啉与叶绿素代谢,癌症途径等通路呈显著负相关。小结GM应用可部分逆转脓毒症带来的肠道菌群多样性的降低,使得脓毒症大鼠贺氏菌及阿克曼氏菌的相对丰度减少,乳酸杆菌的相对丰度增加,改善了脓毒症肠道菌群失调。第二部分 甲磺酸加贝酯对脓毒症大鼠代谢组学的影响方法1.收集各组大鼠粪便样本用于非靶向代谢组学检测,使用液相色谱质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）将代谢物进行色谱分离,并采集质谱数据的二级信息。2.将获得的原始数据进行处理,得到包含质荷比、保留时间和峰强度的数据集。将数据集使用归一化的方法处理后,注释代谢物。3.使用非监督的主成分分析（Principal components analysis,PCA）分析各组之间的代谢物变化。应用正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA）展示两组间的的代谢差异。采用单因素方差分析和Tukey’s事后检验来分析组间差异数据。使用MetaboAnalyst 3.0软件对代谢物进行通路分析。另外,将组间差异菌群和差异代谢物进行相关性分析。4.统计CLP术后24小时各组大鼠死亡率,将收集的各组肺组织进行苏木素-伊红（Hematoxylinand eosin,HE）染色并观察其病理改变。结果1.脓毒症大鼠代谢组学变化显著。PCA显示SC组与GM组相距较近,与CLP组明显分离。OPLS-DA显示,CLP组与SC组、CLP组和GM组可根据其代谢差异分为不同的群且区分显著。2.使用MetaboAnalyst 3.0和KEGG数据库分析CLP组和GM组之间不同的代谢物通路,结果表明GM主要调控脓毒症大鼠的鞘脂代谢（Sphingolipid metabolism）,组氨酸代谢（Histidine metabolism）,类固醇生物合成（Steroid biosynthesis）,甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）及初级胆汁酸生物合成（Primary bile acid biosynthesis）等代谢途径。3.重点菌属与代谢通路上的差异代谢物之间存在相关性。在正离子模式下,CLP富含的阿克曼氏菌与鹅去氧胆酸3-硫酸盐（Chenodeoxycholic acid 3-sulfate）,胆固醇（Cholesterol）,LysoPE（16:1（9Z）/0:0）,LysoPE（16:0/0:0）,LysoPE（15:0/0:0）,PC-M6 呈显著正相关,与 15-KETE,胆碱（Choline）,鞘氨醇（Sphinganine）呈显著负相关。CLP富含的贺氏菌与鹅去氧胆酸3-硫酸盐,Calystegin A3,[10]-姜酮（[10]-Gingerdione）呈显著正相关,与15-KETE呈显著负相关。CLP富含的变形杆菌与鹅去氧胆酸3-硫酸盐,胆固醇,LysoPE（16:0/0:0）,LysoPE（15:0/0:0）,[10]-姜酮呈显著正相关,与15-KETE呈显著负相关。在负离子模式下,CLP富含的阿克曼氏菌与喹啉酸（Quinolinic acid）呈显著正相关,与白三烯B4（Leukotriene B4）,9,10-DHOME,脱氧胆酸（Deoxycholic acid）,L-半胱氨酸（L-Cysteine）,苯乙酰甘氨酸（Phenylacetylglycine）,N-乙酰缬氨酸（N-Acetylvaline）,α-亚麻酸（Alpha-linolenic acid）呈显著负相关。CLP富含的贺氏菌与喹啉酸,5a-四氢皮质酮（5a-Tetrahydrocorticosterone）呈显著正相关,与白三烯B4,9,10-DHOME,间香豆酸（m-Coumaric acid）呈显著负相关。CLP富含的变形杆菌与喹啉酸,5a-四氢皮质酮,皮质醇（Cortisol）呈显著正相关,与白三烯B4,9,10-DHOME,脱氧胆酸,N-α-乙酰赖氨酸（N-Alpha-acetyllysine）,油酰甘氨酸（Oleoyl glycine）,间香豆酸,α-亚麻酸呈显著负相关。此外,GM富含的乳酸杆菌与白三烯B4,9,10-DHOME,N-α-乙酰赖氨酸,N-乙酰缬氨酸,苯乙酰甘氨酸,油酰甘氨酸呈显著正相关,与喹啉酸呈显著负相关。4.脓毒症CLP组大鼠的死亡率明显高于SC组和GM组。另外,HE染色结果显示,CLP组肺脏组织炎性浸润、水肿以及结构破坏较SC组及GM组明显加重。小结GM主要通过调控鞘脂代谢,组氨酸代谢,类固醇生物合成,甘油磷脂代谢及初级胆汁酸生物合成等代谢途径改变CLP组代谢谱。CLP富含的阿克曼氏菌,贺氏菌和变形杆菌与LysoPE（15:0/0:0）、喹啉酸呈显著正相关,GM富含的乳酸杆菌与LysoPE（15:0/0:0）、喹啉酸呈显著负相关。CLP富含的阿克曼氏菌,贺氏菌和变形杆菌与白三烯B4,9,10-DHOME呈显著负相关,GM富含的乳酸杆菌与白三烯B4,9,10-DHOME呈显著正相关。另外,GM也能够减轻脓毒症所致的肺脏组织损伤,提高脓毒症大鼠生存率。结论GM可影响乳酸杆菌,阿克曼氏菌,贺氏菌等菌属的变化,并调节LysoPE（15:0/0:0）,喹啉酸,白三烯B4,9,10-DHOME等差异代谢物的相对丰度,减轻脓毒症所致的急性肺损伤,这为GM应用于脓毒症治疗提供了 一个潜在的机制。