【摘 要】
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硅（Si）作为一种有益元素,对植株生长及其抵抗多重生物和非生物胁迫具有重要的作用。水稻（Oryza sativa）是典型硅累积型禾本科（Poaceae）作物,其吸收的硅大部分会在特化的硅化细胞内或细胞壁表面沉积形成二氧化硅,另有微量硅可与水稻细胞壁中的半纤维素结合形成有机硅。目前水稻硅营养的研究内容广泛,但细胞壁中微量有机硅的形成方式及生物学作用仍不清楚。因此,本实验选取缺硅和加硅培养的水稻悬浮细
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硅（Si）作为一种有益元素,对植株生长及其抵抗多重生物和非生物胁迫具有重要的作用。水稻（Oryza sativa）是典型硅累积型禾本科（Poaceae）作物,其吸收的硅大部分会在特化的硅化细胞内或细胞壁表面沉积形成二氧化硅,另有微量硅可与水稻细胞壁中的半纤维素结合形成有机硅。目前水稻硅营养的研究内容广泛,但细胞壁中微量有机硅的形成方式及生物学作用仍不清楚。因此,本实验选取缺硅和加硅培养的水稻悬浮细胞为研究载体,结合提取的细胞壁及半纤维素组分,深入探究细胞壁上有机硅的交联组分及生物学功能。实验主要借助糖化学和物理化学等新型跨学科技术,利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器（HPAEC-PAD）和基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）解析缺硅和加硅细胞壁间的组分差异;结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、X-射线光电子能谱（XPS）等物理化学手段检测有机硅在木聚糖和木葡聚糖两种半纤维素组分中的含量及结合形态;利用原子力显微镜（AFM）在单分子尺度上量化木聚糖酶和木葡聚糖酶在细胞壁上特异性结合位点,揭示了有机硅在半纤维素中的具体交联组分为木葡聚糖;以及利用AFM原位成像半纤维素酶和纤维素酶水解细胞壁的动态过程及测量细胞壁纳米力学性能,探讨了有机硅在活体细胞中的生物学功能。最后,利用CRISPR/Case 9基因编辑技术构建木葡聚糖6-木糖基转移酶基因（OsXXT1）突变的水稻悬浮细胞和植株,进一步证明了硅-木葡聚糖复合物的存在并验证其功能,具体结果如下:1.细胞壁上存在的有机硅主要与半纤维素中的木葡聚糖交联借助GC-MS、HPAEC-PAD以及MALDI-TOF MS分析缺硅和加硅处理的水稻悬浮细胞的细胞壁组分,结果表明缺硅或者加硅处理的细胞壁组分间无明显差异;然而,木葡聚糖酶处理细胞壁后,缺硅细胞壁释放的寡糖含量显著大于加硅细胞壁。同时,ICP-MS测定有机硅在加硅细胞的木葡聚糖中的含量为103.7±10.6μg g-1,显著高于加硅细胞木聚糖(6.1±2.3μg g-1)的含量。XPS在木葡聚糖的Si 2p谱图中发现一个明显的101.3 e V的峰,该峰可能归属于Si-O-C或O-Si-C化学键,说明细胞壁上的硅可与半纤维组分中的木葡聚糖共价交联。将木葡聚糖酶修饰在AFM针尖上,量化木葡聚糖酶在缺硅和加硅细胞壁表面特异性结合位点的数量。结果表明,缺硅细胞壁表面的特异性结合位点数量显著高于加硅细胞壁,说明有机硅的交联可以减少木葡聚糖酶在细胞壁上的识别,在单分子尺度上证明了有机硅与木葡聚糖的交联。2.硅-木葡聚糖交联改善细胞壁的形貌、酶解抗性以及力学性能为检测有机硅对细胞壁功能的影响,借助AFM原位成像半纤维素酶和纤维素酶水解缺硅和加硅细胞壁的动态过程,并测定两种硅处理细胞壁的机械性能。在通入纤维素后,加硅细胞壁表面仅观察到单根纤维素微丝发生降解,而缺硅细胞壁上有多根微丝完全降解。AFM测定出加硅细胞壁的杨氏模量为1.40±0.11 Mpa,显著高于缺硅细胞壁的模量0.84±0.18 Mpa。以上结果表明,细胞壁上有机硅与木葡聚糖的交联可以增强细胞壁对纤维素酶的水解抗性,改善细胞壁的力学性能,进而维持了细胞壁的稳定性。3.OsXXT1基因突变体证明硅-木葡聚糖复合物的存在及其功能利用CRISPR/Case9基因编辑技术,构建了OsXXT1基因突变的水稻悬浮细胞和植株作为研究材料。利用GC-MS测定细胞壁木葡聚糖中的多种单糖含量,发现突变体木葡聚糖中的半乳糖、葡聚糖,特别是木糖的含量显著低于野生型。随后,MALDI-TOF MS也未在突变体的木葡聚糖提取物中检测到任何含木糖基的寡糖片段的信号峰,表明OsXXT1基因的突变会影响木葡聚糖的合成。ICP-MS和XPS测定后发现,突变体细胞壁中有机硅的浓度也显著低于野生型,进一步表明硅可能与木葡聚糖,特别是其侧链的木糖存在相关性。突变体细胞中,硅-木葡聚糖复合物的缺乏会影响细胞壁的形貌、酶解抗性以及力学性能;而单细胞壁力学性能的变化,会进一步在植株水平上影响种子的萌发以及植株的产量。
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