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目的：
新生儿呼吸暂停（apnea neonatorum）指新生儿呼吸停止超过20秒，或呼吸停止小于20秒，伴有心跳减慢（＜100次/分钟），肌肉张力降低，发绀或皮肤苍白。新生儿呼吸调节能力较差，反复严重的新生儿呼吸暂停可导致低氧血症、高碳酸血症、低碳酸血症等，引起脑损伤，影响脑部发育。如果无法及时纠正，甚至可以导致新生儿猝死。新生儿呼吸暂停的发病率很高，在早产儿更为常见。治疗新生儿呼吸暂停对提高新生儿特别是早产儿的存活率有着重要的意义。在临床上，药物治疗是治疗新生儿呼吸暂停的主要手段之一，其中，咖啡因作为一线用药应用于预防和治疗新生儿呼吸暂停有40多年的历史，但其作用于呼吸中枢的具体机制尚不清楚。内侧臂旁核（medialparabrachial nucleus，MPB）位于脑桥，是脑桥呼吸调节中枢的一部分。既往研究表明，孕期暴露于咖啡因后，MPB的A1受体明显增高，提示MPB很可能是咖啡因作用于呼吸中枢的重要靶点。因此我们推测，咖啡因可能通过阻断MPB的A1受体改善呼吸暂停。本实验采用电生理膜片钳技术，通过使用腺苷A1受体拮抗剂8-环戊-1,3-二甲基黄嘌呤（8-cyclopentyl-1,3-dimethyl-xanthine，CPT）、腺苷A2a受体拮抗剂伊曲茶碱（Istradefylline，KW6002）做对比，记录自发性动作电位、自发性兴奋性/抑制性突触后电流（spontaneous excitatory/inhibitory postsynaptic currents，sEPSC/sIPSC），观察咖啡因对不同年龄段野生型小鼠MPB神经元的作用，探究作用的受体亚型，探讨咖啡因对呼吸中枢的作用及机制，为咖啡因治疗新生儿呼吸暂停和靶向药物的研究提供理论依据。
方法：
选用野生型（wild type，WT）清洁级健康C57BL/6小鼠，2~16周龄，体重8~25克，以出生当日为P0天，年龄＜P21定义为新生小鼠，P22-P30定义为幼年小鼠，P31-P60定义为少年小鼠，年龄＞P61定义为成年小鼠。在电生理实验中，分为咖啡因组（500μmol/L）、CPT组（2μmol/L）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）组（0.2‰），KW6002组（0.2μmol/L，2μmol/L），河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）组（1μmol/L），sEPSC组，sIPSC组，以神经细胞动作电位频率（无自发放的MPB细胞被人为钳制在自发放频率1-10Hz）、神经细胞膜电位、自发性突触后电流等为指标，观察咖啡因及各药物对MPB神经细胞的作用；以相邻核团蓝斑（locus ceruleus，LC）为对照，观察咖啡因作用的核团特异性。
结果：
（1）MPB细胞电生理特性：共钳制小鼠MPB核团神经元219个，其中新生组n=64、幼年组n=62、少年组n=65、成年组n=28。新生组及幼年组的膜电容分别与少年组、成年组对比存在统计学差异，（P＜0.05）；新生组与幼年组间自发放概率存在统计学差异（P=0.002）；各年龄段超极化激活（hyperpolarization-activated，Ih）电流及低阈值发放（low-threshold spiking，LTS）均无统计学差异（P＞0.05）。
（2）咖啡因对MPB细胞的兴奋作用：无预先加入腺苷的情况下，总共测试28个位于MPB的神经细胞，其中新生组n=9、幼年组n=5、少年组n=6、成年组n=8。其中被兴奋的细胞数n=21，总可兴奋率R=75.0%，其中新生组n=8，可兴奋率r=88.89%，幼年组n=4，r=80.00%、少年组n=5，r=83.33%，成年组n=4，r=50%。各年龄组可兴奋率无差异（P=0.275）。总共钳制6个位于LC的神经细胞，其中被兴奋的细胞数n=1，可兴奋率r=16.67%。咖啡因对MPB神经细胞和LC神经细胞的兴奋率差异具有统计学意义（P=0.014）。
（3）CPT和KW6002对MPB细胞的作用：用CPT模拟咖啡因的作用，进行药理学测试。总共测试12个位于MPB的神经细胞，其中被兴奋的细胞数n=9，可兴奋率R=75%。用KW6002模拟咖啡因的作用，进行药理学测试，总共测试8个位于MPB的神经细胞，其中被兴奋的细胞数n=1，可兴奋率R=12.50%。对照组采用0.02‰浓度的DMSO进行实验。DMSO灌注前后细胞兴奋性差异没有统计学意义。CPT与咖啡因对比，对小鼠MPB神经元细胞的兴奋率差异没有统计学意义（P＞0.05），KW6002与咖啡因对比，对小鼠MPB神经元细胞的作用有统计学差异（P=0.03）。
（4）TTX对咖啡因效果的阻断作用：在TTX（1μmol）存在的情况下，共测试3个MPB神经元，咖啡因的兴奋效果消失，可兴奋细胞为0，可兴奋率为0。咖啡因加药前后细胞膜电位变化无统计学意义（P＞0.05）。
（5）咖啡因对MPB神经元sEPSC/sIPSC的影响：在γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）受体拮抗剂木防己苦毒（picrotoxinin，PTX）存在的情况下，咖啡因加药前后MPB细胞的sEPSC频率增高，幅度增大（P＜0.05）；在谷氨酸受体阻断剂二羟基喹酮（2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo[f]quinoxaline-2,3-dione，NBQX）及2-氨基-5-磷酰基戊酸（DL-2-Amino-5-phosphonovaleric acid，AP5）存在的情况下，咖啡因加药前后MPB细胞的sIPSC频率无统计学差异（P＞0.05），幅度无统计学差异（P＞0.05）。
结论：
1.咖啡因可以兴奋MPB神经元，兴奋率与年龄无关。
2.咖啡因几乎不能兴奋LC神经元。
3.咖啡因通过阻断A1受体兴奋MPB神经元。
4.咖啡因可能通过增加神经元突触间兴奋性传递效率兴奋MPB神经元。
新生儿呼吸暂停（apnea neonatorum）指新生儿呼吸停止超过20秒，或呼吸停止小于20秒，伴有心跳减慢（＜100次/分钟），肌肉张力降低，发绀或皮肤苍白。新生儿呼吸调节能力较差，反复严重的新生儿呼吸暂停可导致低氧血症、高碳酸血症、低碳酸血症等，引起脑损伤，影响脑部发育。如果无法及时纠正，甚至可以导致新生儿猝死。新生儿呼吸暂停的发病率很高，在早产儿更为常见。治疗新生儿呼吸暂停对提高新生儿特别是早产儿的存活率有着重要的意义。在临床上，药物治疗是治疗新生儿呼吸暂停的主要手段之一，其中，咖啡因作为一线用药应用于预防和治疗新生儿呼吸暂停有40多年的历史，但其作用于呼吸中枢的具体机制尚不清楚。内侧臂旁核（medialparabrachial nucleus，MPB）位于脑桥，是脑桥呼吸调节中枢的一部分。既往研究表明，孕期暴露于咖啡因后，MPB的A1受体明显增高，提示MPB很可能是咖啡因作用于呼吸中枢的重要靶点。因此我们推测，咖啡因可能通过阻断MPB的A1受体改善呼吸暂停。本实验采用电生理膜片钳技术，通过使用腺苷A1受体拮抗剂8-环戊-1,3-二甲基黄嘌呤（8-cyclopentyl-1,3-dimethyl-xanthine，CPT）、腺苷A2a受体拮抗剂伊曲茶碱（Istradefylline，KW6002）做对比，记录自发性动作电位、自发性兴奋性/抑制性突触后电流（spontaneous excitatory/inhibitory postsynaptic currents，sEPSC/sIPSC），观察咖啡因对不同年龄段野生型小鼠MPB神经元的作用，探究作用的受体亚型，探讨咖啡因对呼吸中枢的作用及机制，为咖啡因治疗新生儿呼吸暂停和靶向药物的研究提供理论依据。
方法：
选用野生型（wild type，WT）清洁级健康C57BL/6小鼠，2~16周龄，体重8~25克，以出生当日为P0天，年龄＜P21定义为新生小鼠，P22-P30定义为幼年小鼠，P31-P60定义为少年小鼠，年龄＞P61定义为成年小鼠。在电生理实验中，分为咖啡因组（500μmol/L）、CPT组（2μmol/L）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）组（0.2‰），KW6002组（0.2μmol/L，2μmol/L），河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）组（1μmol/L），sEPSC组，sIPSC组，以神经细胞动作电位频率（无自发放的MPB细胞被人为钳制在自发放频率1-10Hz）、神经细胞膜电位、自发性突触后电流等为指标，观察咖啡因及各药物对MPB神经细胞的作用；以相邻核团蓝斑（locus ceruleus，LC）为对照，观察咖啡因作用的核团特异性。
结果：
（1）MPB细胞电生理特性：共钳制小鼠MPB核团神经元219个，其中新生组n=64、幼年组n=62、少年组n=65、成年组n=28。新生组及幼年组的膜电容分别与少年组、成年组对比存在统计学差异，（P＜0.05）；新生组与幼年组间自发放概率存在统计学差异（P=0.002）；各年龄段超极化激活（hyperpolarization-activated，Ih）电流及低阈值发放（low-threshold spiking，LTS）均无统计学差异（P＞0.05）。
（2）咖啡因对MPB细胞的兴奋作用：无预先加入腺苷的情况下，总共测试28个位于MPB的神经细胞，其中新生组n=9、幼年组n=5、少年组n=6、成年组n=8。其中被兴奋的细胞数n=21，总可兴奋率R=75.0%，其中新生组n=8，可兴奋率r=88.89%，幼年组n=4，r=80.00%、少年组n=5，r=83.33%，成年组n=4，r=50%。各年龄组可兴奋率无差异（P=0.275）。总共钳制6个位于LC的神经细胞，其中被兴奋的细胞数n=1，可兴奋率r=16.67%。咖啡因对MPB神经细胞和LC神经细胞的兴奋率差异具有统计学意义（P=0.014）。
（3）CPT和KW6002对MPB细胞的作用：用CPT模拟咖啡因的作用，进行药理学测试。总共测试12个位于MPB的神经细胞，其中被兴奋的细胞数n=9，可兴奋率R=75%。用KW6002模拟咖啡因的作用，进行药理学测试，总共测试8个位于MPB的神经细胞，其中被兴奋的细胞数n=1，可兴奋率R=12.50%。对照组采用0.02‰浓度的DMSO进行实验。DMSO灌注前后细胞兴奋性差异没有统计学意义。CPT与咖啡因对比，对小鼠MPB神经元细胞的兴奋率差异没有统计学意义（P＞0.05），KW6002与咖啡因对比，对小鼠MPB神经元细胞的作用有统计学差异（P=0.03）。
（4）TTX对咖啡因效果的阻断作用：在TTX（1μmol）存在的情况下，共测试3个MPB神经元，咖啡因的兴奋效果消失，可兴奋细胞为0，可兴奋率为0。咖啡因加药前后细胞膜电位变化无统计学意义（P＞0.05）。
（5）咖啡因对MPB神经元sEPSC/sIPSC的影响：在γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）受体拮抗剂木防己苦毒（picrotoxinin，PTX）存在的情况下，咖啡因加药前后MPB细胞的sEPSC频率增高，幅度增大（P＜0.05）；在谷氨酸受体阻断剂二羟基喹酮（2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo[f]quinoxaline-2,3-dione，NBQX）及2-氨基-5-磷酰基戊酸（DL-2-Amino-5-phosphonovaleric acid，AP5）存在的情况下，咖啡因加药前后MPB细胞的sIPSC频率无统计学差异（P＞0.05），幅度无统计学差异（P＞0.05）。
结论：
1.咖啡因可以兴奋MPB神经元，兴奋率与年龄无关。
2.咖啡因几乎不能兴奋LC神经元。
3.咖啡因通过阻断A1受体兴奋MPB神经元。
4.咖啡因可能通过增加神经元突触间兴奋性传递效率兴奋MPB神经元。