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第一部分Gasdermin D在糖尿病肾组织及高糖诱导足细胞中的表达目的:糖尿病是全球范围内的一种威胁人类健康的慢性疾病,发病率高,致死率高、多脏器受累,预后差。统计数据显示,到2045年糖尿病患者将达到7.83亿,在此期间,世界人口估计增加20%,而糖尿病患者人数估计增加46%;2021年统计分析显示:有670万成年人因糖尿病或其并发症死亡,大约1/3的糖尿病死亡年龄小于60岁。糖尿病的慢性并发症影响肾脏、心脏、眼睛、血管和周围神经等全身各个器官。糖尿病是慢性肾脏病(chronic kidneydisease,CKD)最常见的继发原因,也是导致终末期肾病(endstage renal disease,ESRD)的主要原因。DKD作为糖尿病患者最严重的微血管并发症之一,其发病率也在逐年上升。目前研究认为DKD是一种由多种炎症因子介导的代谢性疾病,具有复杂的生理和病理机制,发病机制未明。目前研究证实,高血糖、脂质代谢紊乱、氧化应激和晚期糖基化终产物和其他损伤相关分子可以通过细胞中的一些特定模式识别受体识别,诱导细胞焦亡的发生,从而导致肾损伤和功能下降。在糖尿病肾病发展过程中,发现NLRP3、白细胞介素1β大量激活,诱导肾固有细胞发生焦亡与肾纤维化、肾小球硬化和肾小管损伤,抑制或敲除NLRP3显示明显肾保护作用。而GSDMD是NLRP3下游分子,GSDMD在糖尿病肾组织中的作用研究尚少。GSDMD(Gasdermin D)是一种新发现的焦亡执行蛋白,与膜磷脂及酸性脂质有特异亲和力,以一种自抑制状态存在于细胞浆,可被多种危险因素激活,如ROS、脂质代谢紊乱,晚期糖基化产物等代谢因素及细菌、病毒等感染。自GSDMD发现之前,IL家族的释放一直未解,目前研究显示GSDMD在细胞膜穿孔是白细胞介素类蛋白分泌所必需的,而白细胞介素-1与足细胞关系密切,白细胞介素-1受体的激活可以通过刺激Akt信号级联来限制肾小球对损伤的易感性。因此推测焦亡执行蛋白GDSMD可能也参与了足细胞损伤。方法:1.GSDMD在糖尿病肾病(DN,diabetic nephropathy)患者肾组织的表达:分2组:DN组:肾病理确诊为2型糖尿病肾病病例20例,对照组(Ctr,control group)10例,临床表现为轻度血尿或蛋白尿的非糖尿病患者,肾活检诊断为轻微肾小球病变,且未合并其他肾小球疾病(如Ig A肾病或膜性肾病)。肾组织常规石蜡包埋,4μm切片,组织进行HE、PAS、PASM、Masson染色及免疫组化检测各组GSDMD蛋白的表达与定位。2.GSDMD在DM大鼠肾组织中的表达:动物模型的建立和标本收集:健康雄性SD大鼠40只,适应性喂养2周后,随机选取10只正常SD大鼠作为对照组(Ctr,control group),饲喂正常饮食(能量比:脂肪12.11%,蛋白质22.47%,碳水化合物65.42%)。其余各组给予高脂饲料(能量比:脂肪45.65%,蛋白质16.46%,碳水化合物37.42%),第4周末糖尿病模型组(DM,diabetic group)(15只)和干预组大鼠(15只)腹腔注射1%STZ链脲佐菌素溶液(sigma,USA),单剂量40mg/kg,每日1次,连续3d。Ctr组大鼠给予相当体积的0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。72h后测定各组大鼠空腹血糖(FBG),当FBG>16.7mmol/L时,判定为糖尿病。从第5周开始,干预组灌胃给予恩格列净(Em,Empagliflozin,15mg/kg/d),Ctr和DM组每天灌胃等量注射用水,连续8周。动物分别于造模成功后8周末处死,禁食6-8小时,处死前10%水合氯醛腹腔注射麻醉并称重,腹主动脉取血用于生化指标的检测;开腹取双侧肾脏去掉被膜并称重,用生理盐水将血液冲洗干净,右肾固定于10%多聚甲醛组织固定液中,用于后续HE、PAS、PASM、Masson染色及免疫组化检测;左肾经液氮处理后冻存-80℃冰箱,用于制备组织匀浆提取肾组织蛋白及RNA。免疫组织化学、western blot检测肾皮质GSDMD、caspase-1β、nephrin的蛋白的表达水平。测量20个具有血管和/或尿极的肾小球的最大轮廓图像,同时测量肾小球系膜面积和毛细血管束面积。3.小鼠足细胞培养、分组和标本收集:永生化小鼠足细胞培养于33℃、5%CO2培养箱,培养基为含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10U/mlγ-IFN的DMEM/F12(5:1)培养基,使其增殖。移入37℃、5%CO2培养箱,应用去除γ-IFN的上述培养基培养,使足细胞逐渐分化成熟。2天换液一次,细胞生长至80%-90%进行传代。将分化成熟的足细胞分为正常浓度糖培养组(NG,normal glucose葡萄糖5.5mmol/L)和高浓度糖培养组(HG,high glucose葡萄糖30mmol/L)分别培养,并于6小时、12小时、24小时和48小时收集细胞,提取总蛋白和RNA,Western blot检测不同时间点GSDMD/GSDMD-N蛋白的表达量,细胞免疫荧光染色检测GSDMD的定位及分布。结果:1.生化指标检测结果显示,DN患者血浆白蛋白、甘油三酯、血BUN、血UA有统计学差异;年龄、血红蛋白、血Scr、24小时尿蛋白较正常对照组有明显统计学差异(P<0.01);2.免疫组化结果显示,DN组患者GSDMD表达明显增加,GSDMD主要分布在肾小管上皮细胞,肾小球足细胞、内皮细胞及系膜细胞。3.糖尿病组大鼠体重明显下降(P<0.01),而肾重及肾重/体重均较Ctr组升高(P<0.01);尿蛋白排泄及血糖升高(P<0.01)。4.HE、PAS、PASM、Masson染色显示DN患者组肾小球系膜基质增宽,基底膜明显增厚,可见K-W结节,局灶性肾小管萎缩和间质纤维化。DM组大鼠肾组织肾小球体积增大,肾小囊间隙变窄,系膜区增宽,肾小球纤维化面积增大,部分肾小管上皮细胞空泡样变性、细胞脱落,基底膜裸露。5.Western blot结果显示,与正常对照组相比,糖尿病大鼠肾皮质GSDMD表达明显升高(P<0.01);免疫组化检测肾组织切片GSDMD密度值表达明显升高,表达量增加(P<0.01)。6.Western blot和q RT-PCR结果显示高糖诱导GSDMD表达随时间而变化,在HG培养24小时达高峰(P<0.01);GSDMD-N的表达及GSDMD-m RNA检测得到一致的结果。免疫荧光显示GSDMD荧光强度明显高于NG,主要聚集于细胞浆。第二部分Gasdermin D通过JNK途径对高糖诱导小鼠足细胞的炎症因子和凋亡蛋白的影响目的:糖尿病肾病早期主要累及肾小球损伤,目前DN仍以蛋白尿作为分期标准。足细胞作为肾小球滤过屏障的组分之一,在DN肾小球硬化中发挥重要的作用。目前认为足细胞炎症和凋亡参与了糖尿病肾病发生和发展。大量数据表明,与非糖尿病小鼠相比,糖尿病小鼠在循环中炎症分子和促炎细胞因子的表达上调,炎症因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18促进DN的进展。高糖诱导足细胞凋亡,裂解caspase-3和Bax/Bcl-2明显增加。GSDMD是焦亡细胞死亡的最终执行者,在典型炎症信号通路中作为激活的caspase-1的直接底物,在非经典通路中作为caspase-11/4/5的直接底物。是联系焦亡与凋亡的关键分子。JNK具有广泛的组织分布,是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员。JNK调节通路的激活可触发多种病理生理过程,在高糖应激细胞损伤中抑制JNK通路通过其抗炎、抗增殖及抗氧化应激发挥重要保护作用。前一部分研究,我们发现GSDMD在糖尿病肾病和高糖环境中小鼠足细胞表达上调,与糖尿病肾组织病理损伤呈正相关,推测GSDMD可能参与了糖尿病肾病的发病过程,然而确切机制未明,是否通过JNK信号通路影响炎症因子及凋亡相关蛋白需要进一步研究。方法:1.筛选最优转染条件,将Lipofectamin 3000转染试剂按不同比例和量与GSDMD Si RNA混合转染足细胞,应用Western blot和q RT-PCR检测GSDMD的表达,选择转染的最佳条件。2.应用Western blot方法检测GSDMD Si RNA对于高糖环境下小鼠足细胞GSDMD、GSDMD-N及synaptopodin蛋白的影响,分组为:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、高糖+空载体组(HG+NC,high-glucose+Si RNA negative control)、高糖+GSDMD Si RNA质粒转染组(high-glucose(30m M)+GSDMD Si RNA(20μM))。刺激24小时后收集细胞,应用western blot和q RT-PCR检测GSDMD、GSDMD-N及synaptopodin的表达,激光共聚焦显微镜检测GSDMD Si RNA足细胞synaptopodin的表达。3.检测敲除GSDMD对高糖诱导足细胞炎症因子的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、高糖+空载体组(HG+NC,high-glucose+Si RNA negative control)、高糖+HG+GSDMD Si RNA质粒转染组(high-glucose(30m M)+GSDMD Si RNA(20μM))。刺激24小时后收集细胞,应用western blot检测IL-1β、IL-6和TNF-a的表达。4.敲除GSDMD对高糖诱导足细胞凋亡相关蛋白的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、高糖+空载体组(HG+NC,high-glucose+Si RNA negative control)、高糖+GSDMD Si RNA质粒转染组(high-glucose(30m M)+GSDMD Si RNA(20μM))。刺激24小时后收集细胞,应用western blot检测Cleaved-caspase-3和Bax/Bcl-2的表达。5.高糖对JNK信号通路活性的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、正常浓度糖培养组+JNK抑制剂(NG+SP:normal glucose+SP600125);高浓度糖培养组+JNK抑制剂(HG+SP:high glucose+SP600125)。刺激24小时后收集细胞,应用western blot检测JNK,p-JNK的表达,应用免疫荧光检测J NK特异抑制剂SP600125后的表达。6.JNK特异抑制后对高糖环境下足细胞炎症因子激活的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、正常浓度糖培养组+JNK抑制剂(NG+SP:normal glucose+SP600125);高浓度糖培养组+JNK抑制剂(HG+SP:high glucose+SP600125)。刺激24小时后收集细胞,应用western blot检测IL-6、IL-1β、TNF-a的表达。7.JNK特异抑制后对高糖环境下足细胞凋亡相关蛋白的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、正常浓度糖培养组+JNK抑制剂(NG+SP:normal glucose+SP600125);高浓度糖培养组+JNK抑制剂(HG+SP:high glucose+SP600125)。培养24小时后收集细胞,应用western blot检测Cleaved-caspase-3、Bax/Bcl-2的表达。8.GSDMD Si RNA基因敲除对HG诱导线粒体ROS产生的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高糖+GSDMD Si RNA质粒转染组(high-glucose(30m M)+GSDMD Si RNA(20μM)。应用Mito SOX红色荧光探针检测mt ROS的水平。9.应用Western blot检测GSDMD Si RNA对高糖环境下MPCs抗氧化应激蛋白SOD2的影响,分组:正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、高糖+空载体组(HG+NC,high-glucose+Si RNA negative control),高糖+GSDMD Si RNA质粒转染组(high-glucose(30m M)+GSDMD Si RNA(20μM))。培养24小时后收集细胞,应用western blot检测SOD2的表达。10.GSDMD Si RNA基因敲除及NAC对HG诱导的小鼠足细胞JNK、p-JNK表达水平的影响,正常浓度糖培养组(NG,葡萄糖5.5mmol/L)、高浓度糖培养组(HG,葡萄糖30mmol/L)、高糖+GSDMD Si RNA质粒转染组(high-glucose(30m M)+GSDMD Si RNA(20μM))、高糖+NAC组:(high glucose(30m M)+NAC(15μM)),培养24小时后收集细胞,应用western blot检测JNK、p-JNK的表达。结果:1.Lipofectamin 3000 3.75ul+p CMV3-GSDMD 20u M+P3000 5ul转染足细胞获得最好的GSDMD表达效果。2.与HG组相比较,GSDMD Si RNA减少了高糖环境下足细胞细胞中GSDMD、GSDMD-N蛋白的表达(P<0.05)。GSDMD Si RNA,改善高糖诱导的synaptopodin表达下降(P<0.05),激光共聚焦显微镜结果显示敲除GSDMD后,synaptopodin蛋白的表达较HG组明显增加。3.在HG组中,IL-1β、IL-6和TNF-a的表达也较高。通过转染GSDMD Si RNA,这些蛋白质的表达显著降低,4.与NG组相比较,HG组细胞中Cleaved-caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表达均明显升高(P<0.05),而敲除GSDMD减少了高糖环境下Cleaved-caspase3、Bax/Bcl-2在足细胞中的表达(P<0.05)。5.高糖环境下p-JNK/JNK升高,与NG组相比有统计学差异(P<0.05)。同时应用JNK特异抑制剂SP600125抑制,JNK、p-JNK表达下降(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果显示,高糖组synaptopodin表达明显下降,应用JNK特异抑制剂SP600125后,synaptopodin表达明显增加。6.Western blot结果示,应用SP600125后,IL-6、IL-1β、TNF-a的表达比HG明显下降(P<0.05),IL-1β下降最明显(P<0.05)。7.与对照组相比,MPCs中的Cleaved-caspase3、Bax/Bcl-2蛋白的表达于高糖环境下刺激24h时明显增加(P<0.05),应用SP600125后,Cleaved-caspase3、Bax/Bcl-2蛋白的表达明显下降(P<0.05)。8.敲除GSDMD可明显改善HG诱导的mt ROS生成增强,敲除GSDMD可明显改善HG诱导的SOD2表达降低(P<0.05)。HG+GSDMD Si RNA和HG+NAC组的p-JNK蛋白表达水平显著低于HG组。HG+GSDMD Si RNA组与HG+NAC组JNK水平无显著性差异。我们的研究表明GSDMD是mt ROS产生的关键调节因子,GSDMD的敲除通过ROS抑制HG诱导的JNK活化。第三部分Empagliflozin对糖尿病肾组织及足细胞GSDMD相关炎症因子和细胞凋亡的干预目的:糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾病的主要原因,并增加心血管事件和死亡的风险。尽管有多种药物和手术方法被用于治疗糖尿病,但效果并不令人满意。目前,调节血糖、血脂和血压水平、增强抗氧化和抑制Ras活化不足以阻止DN的进展。足细胞丢失与焦亡密切相关。焦亡是一种程序性细胞死亡,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体被激活时,会进一步激活caspase-1,然后caspase-1会切割Gasdermin D(GSDMD)并释放其N端结构域,从而穿透细胞膜并形成膜孔,膜破裂、细胞渗透压、DNA裂解、细胞内容物和炎症介质的释放导致强烈的炎症反应。钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂是一种新型口服降糖药,作用于近曲小管,调节肾小球滤过90%的葡萄糖重吸收。2014年被批准用于治疗成人2型糖尿病。Empagliflozin是选择性钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂。临床研究表明,SGLT2可降低血糖、血压和利尿,抑制RAAS活化,研究证实:Empagliflozin降低了2型糖尿病小鼠胰腺和肾脏组织中的氧化应激和细胞死亡,是否是通过足细胞炎症因子及凋亡发挥作用,目前尚不清楚。方法:1.SD大鼠培养及组织标本的处理及肾皮质蛋白提取同第一部分及第二部分。2.为了确定恩格列净安全有效的浓度,将足细胞分组:正常对照组、Empagliflozin 100nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm组。细胞传代贴壁后,将原培养基弃去,更换为含有相应浓度的Empagliflozin DMEM/F12培养基,培养48h后,计算各组足细胞活力。3.MTS实验结果显示在NG培养48h时条件下,0.01、0.1和1n M的Empagliflozin可维持稳定足细胞活性,然而在大于10n M时,Empagliflozin抑制了足细胞的活性。在HG培养48h时,0.01、0.1和1n M浓度的Empagliflozin可保护足细胞免受高糖诱导的细胞活性减低,Empagliflozin在大于10n M时加重其细胞损伤。本部分实验以Empagliflozin浓度0.1n M被用于后续的研究。结果:1.Empagliflozin降低糖尿病大鼠肾皮质炎症因子的水平与Ctr组相比,DM组的nephrin表达显著下调,而DM+Em组逆转DM组下调的nephrin表达(P<0.01)。DM组中的caspase-1、Cleave-Caspase-1、GSDMD、Cleave-IL-1β较Ctr组显著上调,应用Empagliflozin后caspase-1、Cleave-caspase-1、GSDMD、Cleave-IL-1β表达下降(P<0.01)。2.Empagliflozin减轻糖尿病大鼠病理损伤,DM组的平均肾小球大小(以平均肾小球直径表示)大于正常组及Empagliflozin组;PASM染色结果显示,DM组糖原沉积明显多与正常组,应用Empagliflozin治疗后糖原沉积面积减少(P<0.01),Masson、PASM染色显示DM组较正常组有明显的病理改变,包括系膜基质扩张和纤维化面积增加(P<0.01)。3.Empagliflozin对足细胞保护作用的分子机制,激光共聚焦显微镜结果显示Empagliflozin共培养后,GSDMD积累明显减少。caspase-1表达趋势与GSDMD表达趋势相同,亮度较GSDMD增强。Western blot显示高糖显著升高细胞浆GSDMD、caspase-1的表达水平(P<0.01)。而Empagliflozin组,GSDMD、caspase-1的表达下降(P<0.05)。4.Empagliflozin抑制HG诱导的足细胞凋亡,Western blot结果显示,足细胞功能蛋白nephrin表达降低,凋亡相关蛋白Bax、caspase-3表达增高,Empagliflozin干预可以提高Nephrin的表达水平35%,同时明显降低了Cleaved-caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2比率(P<0.01);流式细胞仪分析各组细胞凋亡率,结果显示,HG组凋亡率是NG组的2.45倍(P<0.01),而Empagliflozin干预组凋亡率是NG组的1.56倍(P<0.01)。5.Empagliflozin对糖尿病大鼠生物参数的影响,与Ctr组相比,DM和DM+Em组大鼠体重下降,DM和DM+Em组大鼠肾重(mg)与体重(g)比值高于Ctr组;DM组和DM+Em组尿蛋白排泄量明显高于Ctr组;DM组和DM+Em组FBG水平高于Ctr组(P<0.01)。结论:1.GSDMD在糖尿病肾病患者、糖尿病大鼠肾组织和高糖环境下的小鼠足细胞中表达均升高,JNK信号通路可能参与了此过程。2.敲除GSDMD及抑制JNK信号通路可以明显减轻高糖诱导小鼠足细胞的炎症因子的激活、足细胞凋亡及氧化应激。3.Empagliflozin可以通过降低糖尿病肾皮质及足细胞炎症因子激活及细胞凋亡发挥肾保护作用。