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目的通过建立人乳腺癌细胞与人成纤维细胞体外共培养模型和荷瘤裸鼠乳腺癌模型,模拟乳腺肿瘤体内外微环境,研究白介素-13(interlukin-13,IL-13)对乳腺癌组织表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)表达及乳腺癌生长的影响,探索IL-13对乳腺癌作用机制的研究,试图为乳腺癌治疗提供新靶点。方法1.细胞体外共培养采用培养板和Transwell小室对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人成纤维细胞株ESF进行体外共培养。根据实验要求分别接种细胞,接种在培养板的细胞用于实验,把接种了细胞的Transwell小室放到细胞已贴壁的培养板中进行共培养。2.RT-q PCR Trizol法提取细胞总RNA,观察A260/A280比值及连续波长吸收峰,判断RNA提取质量。逆转录合成c DNA主要步骤:总RNA溶液11μL(约0.6～0.8μg),随机引物1μL,5×Reaction Buffer 4μL,Ribo Lock?RNase抑制剂1μL(20 U/μL),2μL(10 m M)d NTP(mix)Revert Aid?MMLV逆转录酶1μL,总体积20μL,混匀,25℃5 min,42℃60 min,70℃5 min终止反应,-20℃保存c DNA。PCR扩增反应主要步骤:IQ SYBR Green Supermix 10μL,顺向引物1μL(10μmo L),逆向引物1μL(10μmo L),c DNA 8μL(10μmo L),总体积20μL;50℃3 min,95℃3 min(IQ SYBR Green Supermix),95℃6 s,60.5℃25 s,40个循环;72℃7 min延伸;熔解曲线65℃-95℃。实验结果由荧光定量PCR分析软件Bio-Rad CFX Manager自动进行统计和计算。3.Western-Blotting洗涤和收集培养的细胞,加入细胞裂解液,4℃,30 min,4℃12000 rpm离心5 min。根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书配制蛋白标准品,酶标仪562 nm比色测定,绘制标准曲线。把待测样品放入96孔板中,加BCA工作液,在酶标仪562 nm下比色测定,记录各孔吸光值,在标准曲线上查得相应蛋白含量。聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳(10%分离胶,5%浓缩胶),每泳道20μg蛋白质,浓缩胶电泳电流为25m A,分离胶电泳电流为30 m A,将蛋白转移至PVDF膜,5%去脂牛奶封闭,一抗分别与PBS、0.1%Tween-20和5%去脂牛奶混合,膜放入该混合液中4℃过夜,洗涤后加入二抗,ECL显色,Image J软件分析各条带光密度。4.建立荷瘤裸鼠乳腺癌模型取100μL细胞悬液(细胞浓度:2×10~6MDA-MB-231细胞,1×10~6ESF细胞)植入6-7周的雌性裸鼠右侧胸壁乳腺内,每隔1天用游标卡尺测量瘤体的最长径(a)和最短径(b),根据公式计算肿瘤体积,肿瘤的体积计算公式:V(mm~3)=1/6πab2。以肿瘤长径达5 mm为成瘤,当肿瘤长径为7 mm左右时,对实验组进行肿瘤组织内多点注射IL-13,每次注射IL-13的总浓度为1μg/kg,每隔1天注射,注射9次。对照组瘤体内给予生理盐水200μL。IL-13干预后的第21天将裸鼠颈椎脱臼处死,将肿瘤组织块放入4%福尔马林固定液中固定。5.免疫荧光实验荷瘤裸鼠肿瘤组织石蜡包埋切片,切片脱蜡后进行免疫荧光实验。主要步骤如下:加0.01M枸橼酸缓冲液(p H 6.0),入微波炉修复抗原,1%BSA 37℃封闭30 min,滴加一抗4℃孵育过夜,室温平衡30 min,滴加荧光二抗,37℃孵育避光60 min,DAPI室温染细胞核10 min,封片。激光共聚焦显微镜下观察,拍照,Image-Pro Plus软件分析荧光强度。6.统计学分析实验结果用mean±SD表示,SPSS Statistics 17.0软件处理实验数据,组间均数比较采用t检验,P<0.05为差异有显著性,P>0.05为差异无显著性。结果1.RT-q PCR检测体外共培养的人成纤维细胞表达EGF m RNA的结果结果显示,与单独培养组和未加IL-13共培养组比较,加入IL-13可上调MDA-MB-231+ESF+IL-13共培养组ESF细胞EGF m RNA水平(P<0.05),ESF单独培养组EGF的表达比其它组低(P<0.05),乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养能增强IL-13对EGF m RNA的上调作用。2.Western-Blotting检测体外共培养的人成纤维细胞表达EGF蛋白的结果实验结果显示,与其它各组比较,ESF+MDA-MB-231+IL-13共培养组ESF细胞EGF蛋白表达上调(P<0.05),表明成纤维细胞在与乳腺癌细胞共培养的状况下,IL-13能促进成纤维细胞表达EGF,肿瘤微环境对IL-13的功能发挥具有协同作用。3.免疫荧光共聚焦显微镜观察荷瘤裸鼠乳腺癌组织EGF表达的结果EGF标记为绿色荧光,ESF+MDA-MB-231+IL-13组的肿瘤组织出现较强的绿色荧光,其它各组的肿瘤组织绿色荧光较弱。Image-Pro Plus软件分析荧光强度显示,ESF+MDA-MB-231+IL-13组EGF的荧光强度与其它各组比较显著增强(P<0.05),MDA-MB-231+IL-13组荧光强度与MDA-MB-231组比较无显著性差异,说明IL-13未上调MDA-MB-231细胞EGF的表达,IL-13的靶细胞主要是成纤维细胞并能上调成纤维细胞EGF的表达。我们观察到在无成纤维细胞的MDA-MB-231组EGF的表达,说明乳腺癌细胞呈现EGF的基础表达,但IL-13对乳腺癌细胞表达EGF无显著影响。4.IL-13对人乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响(1)移植瘤HE染色证实为癌组织。(2)实验组注射IL-13前,ESF+MDA-MB-231+IL-13组的肿瘤体积与ESF+MDA-MB-231组比较,无显著性差异(P>0.05)。注射IL-13后第7天至第21天,ESF+MDA-MB-231+IL-13组与ESF+MDA-MB-231组的肿瘤体积差异有显著性(P<0.05),表明IL-13可促进人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长。(3)根据人乳腺癌裸鼠移植瘤生长曲线,ESF+MDA-MB-231+IL-13组肿瘤生长较ESF+MDA-MB-231组更快。(4)ESF+MDA-MB-231组肿瘤生长指数为5.73,ESF+MDA-MB-231+IL-13组肿瘤生长指数为11.43。ESF+MDA-MB-231+IL-13组肿瘤生长指数是ESF+MDA-MB-231组的1.99倍。上述实验结果表明IL-13可促进人乳腺癌裸鼠移植瘤生长。5.人乳腺癌组织切片IL-13免疫组化染色结果胞浆出现棕色颗粒为IL-13表达阳性。用Image-pro-plus 5.1软件测量乳腺癌组和非乳腺癌组织切片免疫组化IL-13的光密度,显示乳腺癌切片IL-13的平均光密度值较非乳腺癌切片IL-13的平均光密度值大(P<0.05),表明IL-13在乳腺癌组织的表达较非乳腺癌组织高。6.人乳腺癌组织切片EGF免疫组化染色结果胞浆出现棕色颗粒为EGF阳性表达。对棕色颗粒的光密度用Image-pro-plus 5.1软件分析,结果显示乳腺癌切片EGF的平均光密度值较非乳腺癌切片EGF的平均光密度值大(P<0.05),说明EGF在乳腺癌组织的表达较非乳腺癌组织高。结论1.IL-13上调体外与人乳腺癌细胞共培养的人成纤维细胞EGF的表达。2.IL-13上调人乳腺癌裸鼠移植瘤组织成纤维细胞EGF的表达。3.IL-13促进人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长。4.人乳腺癌组织高表达IL-13和EGF。