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研究背景:造影剂肾病（contrast-induced nephropathy,CIN）是指排除其他疾病影响的前提下,在造影剂注射后短时间内出现的急性肾功能不全。冠脉介入手术的不断进步和影像学硬件设施的快速升级,为心脑血管系统疾病的诊治提供了强有力的支撑,同时造影剂的大量使用及患者合并的基础疾病增多使得CIN成为了心导管术及冠脉介入治疗术后的常见并发症,CIN目前已成为医院获得性肾功能受损的主要原因之一。CIN的诊断标准尚不完全统一,根据KDIGO的最新推荐,CIN的定义为:造影剂使用后48 h内肌酐水平较基线水平上升≥0.3 mg/d L（26.5μmol/L）,或在7天内升高超过1.5倍基线值。相较于正常人群而言,合并有慢性肾脏病（CKD）、糖尿病及高血压等基础疾病人群的CIN发病率明显增加。对于已确诊的CIN,目前临床上缺乏有效的手段逆转CIN的疾病进展。因此,就如何有效预防或改善由于造影剂使用导致的急性肾功能损害一直是医学领域关注的热点问题。目前普遍认为,造影剂肾病的发病机制与造影剂的毒性作用、肾脏血流灌注改变、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等关系密切。其中氧化应激被较多关注。造影剂由于自身独特的高粘滞性、高渗透性,相对于其他药物而言可延长其在肾脏的滞留时间,对细胞造成毒性作用,导致肾小管上皮细胞大量坏死,肾小球滤过率下降。同时可影响血管内皮细胞的正常生理功能,使具有扩张血管效应的物质生成减少,导致肾血管持续收缩,加重肾脏组织缺血、缺氧。上述各阶段均可产生过量的活性氧物质（reactive oxygen species,ROS）,ROS可抑制一氧化氮合酶（nitric oxide synthetase,NOS）和前列环素合酶的功能,导致一氧化氮（nitric oxide,NO）和前列腺素（prostaglandin,PG）生成减少,进一步加重肾脏损伤。有研究发现,降低肾脏ROS水平可减轻CIN的损伤。瞬时受体电位通道A1（transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1）是哺乳动物细胞膜锚定蛋白TRP亚家族成员之一,是一种对Ca2+有良好通透性的非选择性阳离子通道蛋白。该通道能被多种活性氧物质的副产物激活,可感受机体内氧化应激水平的变化。TRPA1可作为细胞膜受体发挥作用,寒冷刺激（＜17℃）、芥末油、桂皮醛、大蒜素可激活TRPA1。既往认为,TRPA1主要表达在心脏、血管、胃肠道、胰腺等组织,TRPA1可感受热、冷和瘙痒、疼痛等伤害性刺激,同时TRPA1参与了血管扩张的调节及炎症反应等过程。近年研究发现,TRPA1在肾脏组织中仍有表达,且在AKI患者的肾小管中表达上调,被认为与AKI进展为CKD密切相关。TRPA1可能与肾脏疾病的发展密切相关,但目前关于TRPA1在造影剂肾病中的作用尚不清楚。因此,本研究以小鼠作为实验对象,构建符合临床病理特征的造影剂肾病模型后,给予TRPA1激动剂异硫氰酸烯丙酯（AITC）及抑制剂HC030031提前干预,通过H＆E染色、TUNEL荧光染色、蛋白印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附（ELISA）等方法技术,观察各实验组小鼠血清肌酐、尿素氮变化情况,肾脏病理改变,肾脏氧化应激水平,肾脏组织中TRPA1及凋亡相关蛋白表达水平的变化。探讨TRPA1在造影剂诱导的肾损伤中的具体作用及机制,以期临床造影剂肾损伤的预防和治疗提供一定的理论参考。研究目的:1、以C57BL/6J小鼠为实验动物,禁水处理后依次腹腔注射吲哚美辛（Indomethacin）、亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）,再通过尾静脉注射碘克沙醇（Iodixanol）,构建符合临床特征的造影剂肾损伤小鼠模型。2、基于构建的造影剂肾病动物模型,利用TRPA1的激动剂AITC和抑制剂HC030031提前干预,通过观察肾脏形态学及功能学的变化,初步探索TRPA1在CIN中的作用及其机制。研究方法:1、取20只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为空白对照组（Control）、造影剂组（CM）、药物组（Indo+L-NAME）、模型组（Indo+L-NAME+CM）,每组5只。预先依次腹腔注射吲哚美辛（Indomethacin）、亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）,再从小鼠尾静脉注射液碘克沙醇（Iodixanol）,给药24小时后收集血液及肾脏标本,分析肾脏功能及形态学改变。2、验证模型构建成功后,取25只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为空白对照组（Control）、造影剂肾病组（CIN）、溶剂对照组（DMSO+CIN）、激动剂组（AITC+CIN）、抑制剂组（HC030031+CIN）,每组5只。造影剂肾病模型构建方法同上,DMSO+CIN组在造模干预前予以等量溶剂处理;AITC+CIN组在造模前30分钟予以AITC腹腔注射;HC030031+CIN组在造模前30分钟予以HC030031腹腔注射。干预后24小时取血液及肾脏标本,观察各组小鼠血清肌酐、尿素氮、肾脏病理改变、TRPA1表达情况、氧化应激水平及细胞凋亡、线粒体形态等情况。研究结果:1、相较于CM组,Indo+L-NAME+CM组的小鼠血清肌酐和尿素氮水平明显上升,差异具有统计学意义（P＜0.01）,且肌酐升高水平达到了造影剂肾病的诊断标准。Control组、CM组、Indo+L-NAME组之间的肌酐和尿素氮水平无统计学意义差异（P＞0.05）。肾脏组织H＆E染色提示:Control组肾小管上皮细胞排列规整,细胞充盈饱满,无明显损伤。CM组可见个别肾小管上皮细胞出现类似空泡样改变,整体损伤不明显。Indo+L-NAME组的肾脏组织排列规整,未见明显损伤。Indo+L-NAME+CM组可见较大范围肾小管上皮细胞脱落和空泡样变性,刷状缘损伤明显,部分基底膜裸露,组织损伤程度较CM组明显加重,差异有统计学意义（P＜0.01）。肾脏组织DHE染色提示:Indo+L-NAME+CM与CM组相比,肾脏组织ROS水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。肾脏组织TUNEL染色提示:与Control组、CM组及Indo+L-NAME相比,Indo+L-NAME+CM肾脏组织出现了更为显著的肾小管上皮细胞凋亡,差异具有统计学意义（P＜0.01）。2、免疫荧光染色发现,正常情况下TRPA1在肾脏组织中有一定量的表达。相较于Control组,CIN组TRPA1的表达有所增加,差异有统计学意义（P＜0.01）;AITC+CIN组与CIN组相比,TRPA1表达明显上调（P＜0.01）,而HC030031+CIN组与CIN组相比,TRPA1表达明显下降（P＜0.01）。肾功能方面,与CIN组相比,AITC+CIN组血清肌酐水平和血清尿素氮水平明显下降（P＜0.01）,HC030031+CIN组血清肌酐水平和血清尿素氮水平明显上升（P＜0.01）。病理改变方面,H＆E染色、TUNEL染色提示AITC+CIN组相较于CIN组,肾小管损伤程度及肾小管上皮细胞凋亡水平显著降低（P＜0.01）,HC030031+CIN组损伤及凋亡程度明显增加（P＜0.01）。DHE染色提示AITC+CIN组与CIN组相比,ROS水平明显下降（P＜0.01）,而HC030031+CIN组ROS水平升高（P＜0.01）。肾脏组织SOD、MDA结果提示,与CIN组相比,AITC+CIN组SOD活力升高（P＜0.01）,MDA含量明显下降（P＜0.01）,而HC030031+CIN组SOD活力明显降低（P＜0.01）,MDA含量明显升高（P＜0.01）。AITC+CIN组与CIN组相比,TRPA1及Bcl-2 m RNA水平增高（P＜0.01）,Bax及Caspase-3 m RNA水平降低（P＜0.01）;HC030031+CIN组与CIN组相比,TRPA1及Bcl-2 m RNA水平降低（P＜0.01）,Bax及Caspase-3 m RNA水平升高（P＜0.01）。AITC+CIN组相较于CIN组,TRPA1及Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05）,而Bax、Caspase-3蛋白表达量相对降低（P＜0.01）;HC030031+CIN组中的Bcl-2蛋白表达下降（P＜0.01）,Bax、Caspase-3蛋白表达量相对增加（P＜0.05、P＜0.01）。电镜下观察到,CIN组及DMSO+CIN组线粒体呈过度分裂状态,线粒体结构完整性被破坏,细胞核皱缩。AITC+CIN组相较于CIN组的线粒体损伤程度有所减轻,而HC030031+CIN组线粒体数量减少,线粒体结构破坏,可见自噬体形成,细胞核皱缩明显。研究结论:1、造影剂给药前禁水处理24小时,予以缩血管药物Indomethacin和L-NAME腹腔注射,再通过尾静脉注射碘克沙醇注射液,使小鼠血清肌酐水平较基线值升高超过0.3 mg/d L（26.5μmol/L）,达到造影剂肾病诊断标准,成功建立造影剂肾病小鼠模型。2、TRPA1的药理激动剂可通过降低肾脏ROS水平,增加抗氧化能力,减少肾小管上皮细胞凋亡,改善线粒体损伤等方式预防CIN的肾脏病理损害和肾功能损伤。