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糖尿病肾病作为一种慢性炎症性疾病,早期即发现巨噬细胞浸润的现象。足细胞炎症性损伤所导致的结构功能改变及死亡是造成蛋白尿发生的重要原因之一。既往研究证实糖尿病肾病中巨噬细胞浸润与足细胞炎症性损伤密切相关。外泌体作为沟通肾脏中浸润的巨噬细胞与肾固有细胞之间的桥梁,也参与调节靶细胞的生命进程。由此我们提出以下假说,高糖培养的巨噬细胞通过外泌体诱导足细胞的炎症性损伤,参与糖尿病肾病的发生发展。目的本研究旨在探讨高糖环境下巨噬细胞来源的外泌体是否诱导足细胞损伤及其具体机制。方法1.首先在正常糖(5.5 mmol/L)或高糖(25 mmol/L)环境下分别培养巨噬细胞,分离其外泌体并使用电镜、western blot鉴定。2.将收集的正常糖或高糖培养的巨噬细胞源性外泌体与足细胞共培养,通过western blot检测足细胞特异性功能蛋白nephrin、podocin和炎症相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β 的表达。3.通过查阅文献选取6个与足细胞损伤相关的miRNAs:miR-217-5p、miR-155、miR-29a、miR-21-5p、miR-27a、miR-27b,使用 qRT-PCR 检测其在两组巨噬细胞源性外泌体中的表达差异。并使用qRT-PCR检测miR-21-5p在与外泌体共培养的足细胞中的表达差异。4.经miR-21-5p inhibitor及inhibitor NC转染高糖培养的巨噬细胞,收集巨噬细胞源性外泌体与足细胞共培养,qRT-PCR分别检测miR-21-5p在两组巨噬细胞源性外泌体中和足细胞中的表达水平。Western blot检测足细胞中nephrin、podocin、NLRP3、caspase-1 和 IL-1 β 的表达。5.以 mimic NC、miR-21-5p mimic、inhibitor NC 和 miR-21-5p inhibitor 转染足细胞,qRT-PCR检测足细胞中miR-21-5p表达水平。Western blot检测足细胞中 nephrin、NLRP3、caspase-1、IL-1β和 A20 的表达。6.通过生物信息学软件预测到miR-21-5p靶向A20的3’-UTR,并采用双荧光素酶报告基因实验验证。7.以3种si-A20转染足细胞,western blot检测足细胞中A20的表达,筛选最佳 si-A20。8.以 si-NC、si-A20、si-A20+inhibitor NC、si-A20+miR-21-5p inhibitor 转染足细胞,western blot检测足细胞中nephrin、NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达。结果1.与正常糖培养的巨噬细胞源性外泌体(NG-M-Exo)干预的足细胞相比,高糖培养的巨噬细胞源性外泌体(HG-M-Exo)干预的足细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达升高,nephrin、podocin 表达降低。2.与NG-M-Exo相比,HG-M-Exo中miR-21-5p表达水平升高的最为显著,其次是miR-155和miR-29a。此外,与HG-M-Exo共培养的足细胞中miR-21-5p表达水平也升高。3.以miR-21-5p inhibitor及inhibitor NC转染高糖培养的巨噬细胞,qRT-PCR结果显示,与inhibitor NC组巨噬细胞源性外泌体(inhibitor NC-Exo)相比,miR-21-5p inhibitor 组巨噬细胞源性外泌体(miR-21-5p inhibitor-Exo)中miR-21-5p表达水平降低,且与miR-21-5p inhibitor-Exo共培养的足细胞中miR-21-5p表达水平也降低。Western blot结果显示,与inhibitor NC-Exo干预的足细胞相比,miR-21-5p inhibitor-Exo 干预的足细胞中 NLRP3、caspase-1、IL-1 β表达降低,nephrin、podocin表达升高。4.以 mimic NC、miR-21-5p mimic、inhibitor NC 和 miR-21-5p inhibitor 转染足细胞,qRT-PCR结果显示,与对照组足细胞相比,miR-21-5pmimic组足细胞中miR-21-5p水平升高,miR-21-5p inhibitor组足细胞中miR-21-5p水平降低。Western blot结果显示,与对照组足细胞相比,miR-21-5p mimic组足细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达升高,nephrin、A20 表达降低;miR-21-5p inhibitor组足细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达降低,nephrin、A20表达升高。5.双荧光素酶报告基因实验证实miR-21-5p通过靶向A20的3’-UTR抑制后者表达水平。6.Western blot结果显示,与si-NC组足细胞相比,si-A20-1组、si-A20-2组、si-A20-3组足细胞中A20的表达均降低,且si-A20-3组足细胞中A20的表达最低。7.以 si-NC、si-A20、si-A20+inhibitor NC、si-A20+miR-21-5p inhibitor转染足细胞,western blot结果显示,与对照组足细胞相比,si-A20组足细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达升高,nephrin 表达降低;si-A20+miR-21-5p inhibitor组足细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达降低,nephrin表达升高。结论1.高糖培养的巨噬细胞源性外泌体通过其内的miR-21-5p诱导足细胞炎症性损伤;2.MiR-21-5p通过靶向抑制抗炎分子A20的表达来诱导足细胞炎症性损伤。