论文部分内容阅读
研究目的:慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）是一种高发病率的疾病,是各种慢性肾脏病不断进展,最终发展而成的终末期肾脏病,严重危害人类健康。王耀光教授临床上常用加减茵陈失笑散方治疗慢性肾衰竭,有效延缓该病进展。本研究基于网络药理学方法,探讨加减茵陈失笑散方治疗CRF的潜在作用靶点和通路,通过动物实验验证不同浓度的加减茵陈失笑散方对腺嘌呤致CRF大鼠的影响及相关通路作用机制,为此方在慢性肾衰竭的临床治疗及推广应用提供科学依据。研究方法:1.通过网络药理学筛选加减茵陈失笑散方的相关活性化合物及其治疗CRF的潜在靶点,对交集靶点基因进行基因本体GO富集分析以及京都基因和基因组数据库KEGG富集分析,构建化合物-靶点网络及蛋白互作网络。2.建立腺嘌呤致肾衰竭大鼠模型,将60只健康级Wistar大鼠分组,除空白组外分别灌胃14天氯沙坦钾和不同浓度的加减茵陈失笑散方汤剂,并与模型组和空白组进行比较分析。观察大鼠一般情况、肾脏大体情况、大鼠体重及肾重/体重比,应用HE染色法和Masson染色法观察肾组织病理变化,对比大鼠血清Scr、BUN和24 h尿蛋白。3.根据网络药理学结果选取PI3K/Akt/m TOR通路作为研究对象,采用Western blot、q RT-PCR技术检测该通路指标变化,验证加减茵陈失笑散方对该通路及相关蛋白的影响。研究结果:1.通过数据库检索“加减茵陈失笑散方”中8味中药（黄芪、炒白术、茵陈、五灵脂、蒲黄炭、酒大黄、煅牡蛎、土茯苓）,共得到85个化学成分,其中槲皮素、熊竹素、山奈酚、棕榈酸睾酮、柚皮素等64个主要成分与慢性肾衰竭相关;涉及靶点219个,其中MAPK3、MAPK1、JUN、RELA、SRC、TP53、AKT1等靶点相关性最大。此外,富集到加减茵陈失笑散方治疗慢性肾衰竭相关生物过程3003个,细胞组分123个,分子功能270个,相关通路191条,其中动脉粥样硬化相关通路、PI3K/Akt信号通路、癌症相关通路、AGE-RAGE等信号通路作用相对明显。2.（1）在饲养及实验期间有2只大鼠脱落。六组大鼠初始体重均正常,无统计学差异（P＞0.05）,精神状况佳,毛发光泽;经过21天腺嘌呤造模后,6组大鼠体重均增长,其中空白组体重明显高于其他组（P＜0.01）;给药14天后,其他五组大鼠体重仍低于空白组（P＜0.05）,其中中药中剂量组大鼠体重略高于模型组（P＜0.05）,中药高剂量组与氯沙坦钾组大鼠体重较模型组显著增长（P＜0.01）。各组肾脏系数也高于空白组:与模型组相比,氯沙坦钾组与中药中剂量组肾脏系数相对较低（P＜0.05）,而中药高剂量组明显低于模型组（P＜0.01）。（2）病理染色结果显示:空白组大鼠肾小球、肾小管、肾间质以及细胞形态未见异常,仅有少量胶原纤维附着沉积。其余各组均出现褐色结晶样沉积,其中模型组病变最为严重,肾小球囊腔扩大,肾小管管壁厚度不均、萎缩、部分坏死,肾间质增生,存在大量胶原纤维聚积,炎症细胞浸润。中药各剂量组及氯沙坦钾组在经过14天给药后,相比模型组组织病理改变较少,高剂量组病理改变最轻。（3）给药14天后,模型组、氯沙坦钾组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组大鼠血清Scr、BUN和24 h尿蛋白量均高于空白组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。各给药组中除中药低剂量组以外,其他给药组各项指标与模型组相比均有所改善,中药高剂量组与氯沙坦钾组改善最为明显（P＜0.001）。3.（1）Western blot检测结果显示,模型组中PI3K、AKT、m TOR、p-PI3K、p-AKT蛋白表达与空白组相比显著升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;加减茵陈失笑散方低剂量组PI3K、Akt的表达低于模型组（P＜0.05）;中剂量组PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达与模型组有差异（P＜0.05）;高剂量组PI3K、AKT、m TOR、p-PI3K、p-AKT蛋白表达相比于模型组均降低（P＜0.05）。（2）q RT-PCR结果显示模型组肾组织的PI3K、AKT、m TOR的m RNA水平明显升高（P＜0.01）,氯沙坦钾组较模型组PI3K、AKT的m RNA表达有所下降（P＜0.05）,各中药组较模型组PI3K、AKT、m TOR水平明均有改善（P＜0.01）,其中高剂量组更为明显。结论:1.网络药理学结果表明加减茵陈失笑散方治疗慢性肾衰竭可能通过多成分、多靶点、多通路共同发挥作用。由槲皮素、熊竹素、山奈酚、棕榈酸睾酮、柚皮素等主要成分通过调控对细菌来源的分子反应、脂多糖的反应、伤口愈合、细胞对化学应激的反应、金属离子反应、细胞对氧化应激的反应等生物过程,干预动脉粥样硬化与癌症的相关通路以及PI3K/Akt、AGE-RAGE等多条信号通路发挥作用。2.加减茵陈失笑散方可以延缓腺嘌呤慢性肾衰竭大鼠的血肌酐、尿素氮水平进一步进展,有效降低尿蛋白,延缓肾脏损伤,且高剂量组较其他剂量组效果显著。3.加减茵陈失笑散方可以调控PI3K/AKT/m TOR通路上相关基因和蛋白表达,证实其治疗慢性肾衰竭可能与调控PI3K/AKT/m TOR通路相关。