论文部分内容阅读
目的
采用高脂饮食喂养载脂蛋白E(Apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠诱导动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)小鼠模型，研究AS与肠道菌群和胆汁酸代谢的关系，以及泻心汤的干预作用和相应的分子机制，为清热解毒法在AS中的应用提供客观依据。
方法
1.理论探讨：通过查阅国内外相关文献，梳理中医学对AS的虚实认识，明晰内生热毒病机在AS形成中的重要性，探讨清热解毒法治疗心血管疾病的研究，和泻心汤干预心血管疾病的研究。从现代医学角度分析AS与脂代谢和炎症、肠道菌群、胆汁酸的关系。
2.实验研究：SPF级雄性C57BL/6J野生型小鼠随机分为2组：对照组、对照组加泻心汤单给药组，ApoE-/-基因敲除小鼠随机分为2组：模型组、模型组加泻心汤给药组。采用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠诱导AS小鼠模型，小鼠每日分别灌服去离子水、泻心汤，连续给药12周；监测小鼠体重、饮水和饮食量；第12周收集小鼠粪便样品。给药结束后，禁食，麻醉眼眶采血，处死小鼠，分别取主动脉、胆囊、肝脏、大肠、盲肠内粪便等。各组小鼠主动脉和大肠组织HE染色观察组织形态结构的变化，检测血脂水平，ELISA法检测血浆TNF-α和IL-1β的表达；采用阿尔新蓝染色和WGA染色观察小鼠大肠组织粘蛋白的变化，采用16SrRNA分析技术对盲肠内粪便进行基因测序；应用RT-PCR检测大肠组织Occludin和肝脏组织Cyp7b1、Cyp8b1、Lxr、FxrmRNA的表达，通过Westernblot技术检测肝脏组织中FXR、TGR5以及AMPK、P38和JNK蛋白的表达；LC-MS技术检测粪便胆汁酸的含量。
结果
1.一般情况：对照组小鼠精神状态可，饮水饮食良好，毛色润泽；模型组部分小鼠有不同程度的烦躁好动，口渴喜饮，大便干结或便秘的表现；泻心汤给药干预后，小鼠烦躁好动，口渴喜饮，大便干结或便秘等表现有所改善。
2.体重、饮水饮食量和大便形态：与对照组相比，模型组小鼠体重增长相对较快，饮水量显著增多(P＜0.01)，饮食量无明显差异，小鼠的粪便颗粒小且便质较干结；与模型组相比，泻心汤给药组小鼠体重增长缓慢(P＜0.05)，饮水量显著减少(P＜0.01)，饮食量无明显差异，粪便颗粒小和便质干结的症状稍有缓解。
3.主动脉HE染色：对照组小鼠主动脉组织内膜表面平滑，内皮细胞排列整齐有序，未见动脉粥样斑块的形成。模型组小鼠主动脉内膜增厚，且主动脉内膜下泡沫样细胞多见，斑块面积显著大于其他各组。泻心汤给药组小鼠主动脉内膜表面损伤降低，仅见少量泡沫样细胞，斑块面积缩小。
4.血脂水平：与对照组相比，模型组小鼠血浆TG、TC、LDL-C水平均显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，泻心汤给药组小鼠TC、LDL-C水平显著降低(P＜0.05)；TG水平在一定程度上降低，但无显著性差异。
5.ELISA检测：与对照组相比，模型组小鼠血浆炎症因子水平TNF-α和IL-1β均显著升高(P＜0.01)；泻心汤给药组与模型组相比血浆TNF-α水平显著降低(P＜0.01)，IL-1β也在一定程度上降低，但无显著性差异。
6.大肠组织染色：
①HE染色：对照组小鼠大肠组织结构完整，肠道固有肌层分布均匀，黏膜层含有大量的杯状细胞；模型组小鼠大肠组织受损，肠道固有肌层变薄，黏膜层的杯状细胞数量减少；泻心汤给药干预后，肠道固有肌层恢复，黏膜层的杯状细胞数量增多。
②阿尔新蓝染色和WGA染色：对照组小鼠肠道杯状细胞结构完整，肠道粘蛋白分泌正常；模型组小鼠大肠组织杯状细胞受损，粘蛋白分泌减少；泻心汤给药组小鼠肠道粘蛋白分泌增多。
7.肠道微生物检测：
①α多样性：与对照组相比，模型组α多样性指数chao1、observedspecies、PDwholetree和Shannon均显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，泻心汤给药组小鼠α多样性指数均显著增加(P＜0.05)。
②属水平的肠道优势菌：对照组中属水平丰度较高的菌为阿克曼氏菌；模型组属水平的菌群丰度较高有：Faecalibaculum、Bifidobacterium、Coriobacteriaceae_UCG-002；泻心汤单给药组中属水平丰度较高的菌为拟杆菌、Ruminococcaceae_UCG-014、Eubacterium_fissicatena_group、Prevotellaceae_UCG-001和Alloprevotella。泻心汤给药组中属水平丰度较高的菌群为脱硫弧菌属、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Eubacterium_xylanophilum_group。
8.RT-PCR检测：与对照组相比，模型组肠道组织Occludin和肝脏组织Cyp7b1、Cyp8b1、Lxr、FxrmRNA表达显著下调(P＜0.01)，泻心汤给药后Occludin、Cyp8b1和LxrmRNA水平显著上调(P＜0.05)，Fxr和Cyp7b1mRNA水平在一定程度上上调，但无统计学差异。
9.Westernblot检测：与对照组相比，模型组肝脏组织蛋白TGR5、AMPK总蛋白水平表达显著下调(P＜0.05)，p-P38蛋白表达显著上调(P＜0.01)，FXR下调，p-JNK上调，但无统计学差异；与模型组相比，泻心汤给药组p-P38显著下调(P＜0.01)，AMPK上调，p-JNK下调，但均无统计学差异。TGR5和FXR未见明显变化。
10.粪便胆汁酸代谢产物：与对照组相比，模型组粪便总胆汁酸，初级胆汁酸和次级胆汁酸均显著增加(P＜0.05)，泻心汤给药组对粪便总胆汁酸和次级胆汁酸有促进作用，但无统计学差异。泻心汤给药组显著降低初级胆汁酸UDCA和TCDCA水平(P＜0.05)。
11.相关性分析：结果显示AS小鼠肠道内阿克曼氏菌，拟杆菌，乳酸菌等有益菌与血脂水平(TG、TC、LDL-C)，促炎因子(TNF-α、IL-1β)，初级胆汁酸和次级胆汁酸呈负相关；与肠道紧密连接蛋白(Occludin)，肝脏胆汁酸合成受体(Cyp7b1、Cyp8b1、Lxr、Fxr )呈正相关；而Anaerotruncus、Mucispirillum等肠道菌属与血脂水平、促炎因子、初级胆汁酸和次级胆汁酸呈正相关，与肠道紧密连接蛋白和肝脏胆汁酸合成受体呈负相关。
结论
1.高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠诱导AS小鼠模型，反应了中医实热证的部分症状特点，泻心汤对AS模型小鼠的体重增长、口渴喜饮和大便干结的症状具有良好的调节作用，推测高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠诱导AS动物模型与中医实热证有关。
2.泻心汤可以改善AS小鼠动脉内膜损伤，调节血脂水平，抑制促炎因子的表达，最终抑制AS斑块的形成。
3.泻心汤可以保护小鼠肠道屏障，增加了肠道菌群的多样性和丰富度，可以在一定程度上调节小鼠肠道菌群，因此改善肠道菌群紊乱可能是泻心汤抑制AS斑块形成的机制之一。
4.泻心汤可以在一定程度上促进胆汁酸的合成，增加胆汁酸池大小，因此调节胆汁酸代谢异常也可能是泻心汤抑制AS斑块形成的机制之一。
5.泻心汤改善AS小鼠血脂水平、促炎因子、肠屏障损伤、胆汁酸代谢异常的作用可能与肠道菌群的变化有一定的关系。
采用高脂饮食喂养载脂蛋白E(Apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠诱导动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)小鼠模型，研究AS与肠道菌群和胆汁酸代谢的关系，以及泻心汤的干预作用和相应的分子机制，为清热解毒法在AS中的应用提供客观依据。
方法
1.理论探讨：通过查阅国内外相关文献，梳理中医学对AS的虚实认识，明晰内生热毒病机在AS形成中的重要性，探讨清热解毒法治疗心血管疾病的研究，和泻心汤干预心血管疾病的研究。从现代医学角度分析AS与脂代谢和炎症、肠道菌群、胆汁酸的关系。
2.实验研究：SPF级雄性C57BL/6J野生型小鼠随机分为2组：对照组、对照组加泻心汤单给药组，ApoE-/-基因敲除小鼠随机分为2组：模型组、模型组加泻心汤给药组。采用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠诱导AS小鼠模型，小鼠每日分别灌服去离子水、泻心汤，连续给药12周；监测小鼠体重、饮水和饮食量；第12周收集小鼠粪便样品。给药结束后，禁食，麻醉眼眶采血，处死小鼠，分别取主动脉、胆囊、肝脏、大肠、盲肠内粪便等。各组小鼠主动脉和大肠组织HE染色观察组织形态结构的变化，检测血脂水平，ELISA法检测血浆TNF-α和IL-1β的表达；采用阿尔新蓝染色和WGA染色观察小鼠大肠组织粘蛋白的变化，采用16SrRNA分析技术对盲肠内粪便进行基因测序；应用RT-PCR检测大肠组织Occludin和肝脏组织Cyp7b1、Cyp8b1、Lxr、FxrmRNA的表达，通过Westernblot技术检测肝脏组织中FXR、TGR5以及AMPK、P38和JNK蛋白的表达；LC-MS技术检测粪便胆汁酸的含量。
结果
1.一般情况：对照组小鼠精神状态可，饮水饮食良好，毛色润泽；模型组部分小鼠有不同程度的烦躁好动，口渴喜饮，大便干结或便秘的表现；泻心汤给药干预后，小鼠烦躁好动，口渴喜饮，大便干结或便秘等表现有所改善。
2.体重、饮水饮食量和大便形态：与对照组相比，模型组小鼠体重增长相对较快，饮水量显著增多(P＜0.01)，饮食量无明显差异，小鼠的粪便颗粒小且便质较干结；与模型组相比，泻心汤给药组小鼠体重增长缓慢(P＜0.05)，饮水量显著减少(P＜0.01)，饮食量无明显差异，粪便颗粒小和便质干结的症状稍有缓解。
3.主动脉HE染色：对照组小鼠主动脉组织内膜表面平滑，内皮细胞排列整齐有序，未见动脉粥样斑块的形成。模型组小鼠主动脉内膜增厚，且主动脉内膜下泡沫样细胞多见，斑块面积显著大于其他各组。泻心汤给药组小鼠主动脉内膜表面损伤降低，仅见少量泡沫样细胞，斑块面积缩小。
4.血脂水平：与对照组相比，模型组小鼠血浆TG、TC、LDL-C水平均显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，泻心汤给药组小鼠TC、LDL-C水平显著降低(P＜0.05)；TG水平在一定程度上降低，但无显著性差异。
5.ELISA检测：与对照组相比，模型组小鼠血浆炎症因子水平TNF-α和IL-1β均显著升高(P＜0.01)；泻心汤给药组与模型组相比血浆TNF-α水平显著降低(P＜0.01)，IL-1β也在一定程度上降低，但无显著性差异。
6.大肠组织染色：
①HE染色：对照组小鼠大肠组织结构完整，肠道固有肌层分布均匀，黏膜层含有大量的杯状细胞；模型组小鼠大肠组织受损，肠道固有肌层变薄，黏膜层的杯状细胞数量减少；泻心汤给药干预后，肠道固有肌层恢复，黏膜层的杯状细胞数量增多。
②阿尔新蓝染色和WGA染色：对照组小鼠肠道杯状细胞结构完整，肠道粘蛋白分泌正常；模型组小鼠大肠组织杯状细胞受损，粘蛋白分泌减少；泻心汤给药组小鼠肠道粘蛋白分泌增多。
7.肠道微生物检测：
①α多样性：与对照组相比，模型组α多样性指数chao1、observedspecies、PDwholetree和Shannon均显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，泻心汤给药组小鼠α多样性指数均显著增加(P＜0.05)。
②属水平的肠道优势菌：对照组中属水平丰度较高的菌为阿克曼氏菌；模型组属水平的菌群丰度较高有：Faecalibaculum、Bifidobacterium、Coriobacteriaceae_UCG-002；泻心汤单给药组中属水平丰度较高的菌为拟杆菌、Ruminococcaceae_UCG-014、Eubacterium_fissicatena_group、Prevotellaceae_UCG-001和Alloprevotella。泻心汤给药组中属水平丰度较高的菌群为脱硫弧菌属、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Eubacterium_xylanophilum_group。
8.RT-PCR检测：与对照组相比，模型组肠道组织Occludin和肝脏组织Cyp7b1、Cyp8b1、Lxr、FxrmRNA表达显著下调(P＜0.01)，泻心汤给药后Occludin、Cyp8b1和LxrmRNA水平显著上调(P＜0.05)，Fxr和Cyp7b1mRNA水平在一定程度上上调，但无统计学差异。
9.Westernblot检测：与对照组相比，模型组肝脏组织蛋白TGR5、AMPK总蛋白水平表达显著下调(P＜0.05)，p-P38蛋白表达显著上调(P＜0.01)，FXR下调，p-JNK上调，但无统计学差异；与模型组相比，泻心汤给药组p-P38显著下调(P＜0.01)，AMPK上调，p-JNK下调，但均无统计学差异。TGR5和FXR未见明显变化。
10.粪便胆汁酸代谢产物：与对照组相比，模型组粪便总胆汁酸，初级胆汁酸和次级胆汁酸均显著增加(P＜0.05)，泻心汤给药组对粪便总胆汁酸和次级胆汁酸有促进作用，但无统计学差异。泻心汤给药组显著降低初级胆汁酸UDCA和TCDCA水平(P＜0.05)。
11.相关性分析：结果显示AS小鼠肠道内阿克曼氏菌，拟杆菌，乳酸菌等有益菌与血脂水平(TG、TC、LDL-C)，促炎因子(TNF-α、IL-1β)，初级胆汁酸和次级胆汁酸呈负相关；与肠道紧密连接蛋白(Occludin)，肝脏胆汁酸合成受体(Cyp7b1、Cyp8b1、Lxr、Fxr )呈正相关；而Anaerotruncus、Mucispirillum等肠道菌属与血脂水平、促炎因子、初级胆汁酸和次级胆汁酸呈正相关，与肠道紧密连接蛋白和肝脏胆汁酸合成受体呈负相关。
结论
1.高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠诱导AS小鼠模型，反应了中医实热证的部分症状特点，泻心汤对AS模型小鼠的体重增长、口渴喜饮和大便干结的症状具有良好的调节作用，推测高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠诱导AS动物模型与中医实热证有关。
2.泻心汤可以改善AS小鼠动脉内膜损伤，调节血脂水平，抑制促炎因子的表达，最终抑制AS斑块的形成。
3.泻心汤可以保护小鼠肠道屏障，增加了肠道菌群的多样性和丰富度，可以在一定程度上调节小鼠肠道菌群，因此改善肠道菌群紊乱可能是泻心汤抑制AS斑块形成的机制之一。
4.泻心汤可以在一定程度上促进胆汁酸的合成，增加胆汁酸池大小，因此调节胆汁酸代谢异常也可能是泻心汤抑制AS斑块形成的机制之一。
5.泻心汤改善AS小鼠血脂水平、促炎因子、肠屏障损伤、胆汁酸代谢异常的作用可能与肠道菌群的变化有一定的关系。