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[目 的]通过行盲肠结扎穿孔术(Cecal Ligation And Puncture,CLP)建立小鼠脓毒症模型,研究人脐带间充质干细胞来源外泌体(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Exosomes,huMSCs-exo)对脓毒症小鼠肠黏膜屏障损伤的保护作用以及机制。[方 法]体外培养人脐带间充质干细胞,收集细胞培养的上清液,通过差速离心法提取huMSCs-exo。通过使用透射电镜观察huMSCs-exo形态、大小、结构;纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)检测原液浓度、颗粒直径分布范围;蛋白印迹实验检测表面标志物CD9、CD63的表达,鉴定huMSCs-exo。选取SPF级Balb/c小鼠58只,雌性,18~22g,按照随机数字表达分为4组,分别为:假手术组(Sham)、脓毒症组(CLP)、去外泌体上清液组(CLP+EXD)、外泌体组(CLP+huMSCs-exo)。通过行盲肠结扎穿孔术(CLP)建立小鼠脓毒症模型。CLP术后3h内,外泌体组根据小鼠体重腹腔注射huMSCs-exo 10ug/g(外泌体蛋白浓度测定lug/ul),注射总体积为200ul。去外泌体上清液组腹腔注射去外泌体上清液200ul,Sham组以及CLP组给予同等体积的1× PBS200ul腹腔注射。观察各组小鼠行为学变化,计算生存率,绘制72h生存曲线。造模后24h显微镜下腹主动脉取血、酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法检测各组血浆炎症因子肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)、白介素 6(Interleukin 6,IL-6)、白介素 13(Interleukin 13,IL-13),以及肠黏膜屏障损伤标志物:肠型脂肪酸结合蛋白(Intestinal Fatty Acid Binding Protein,IFABP)以及二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)的表达含量;收集小肠组织行病理切片HE染色,比较各组小肠组织损伤程度及炎症浸润情况;实时定量多聚酶链反应(Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)、蛋白印迹实验(Western blot)检测各组小肠组织中高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Protein Box 1,HMGB1)以及其下游信号分子核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)mRNA 以及蛋白的表达水平。[结果]1.外泌体鉴定结果:(1)透射电子显微镜下可观察到,大小较为均一,呈圆形或者椭圆形的膜性囊泡,囊泡中心部分可见低电子密度区域直径约在100nm左右,符合间充质干细胞外泌体形态学特征。(2)NTA分析结果显示:未经稀释原溶液中粒子颗粒浓度为1.6× 1012 Particles/ml,峰值在108.2 nm,符合间充质干细胞外泌体直径大小。(3)蛋白免疫印迹法检测提取物高表达间充质干细胞外泌体表面特异性阳性标志物CD9、CD63。综合以上结果提示提取的囊泡样物质符合huMSCs-exo的基本特性。2.成功建立了小鼠脓毒症模型:4组小鼠72h生存率分别为,100%、37.5%、62.5%、75%。与Sham组相比,CLP组小鼠生存时间明显缩短(P<0.05),EXO组与EXD组平均生存时间均不同程度延长,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.术后24h血浆中炎症因子、肠黏膜屏障损伤标志物,ELISA法检测结果显示:与Sham组比,CLP组TNF-α、IL-6、IFABP、DAO水平显著升高(P<0.05),IL-13水平无明显差异(P>0.05);与CLP组进行比较,EXO组以及EXD组TNF-α、IL-6、IFABP、DAO表达水平显著降低(P<0.05),EXO组IL-13水平显著升高(P<0.05);与EXD组进行比较,EXO组TNF-α、IL-6、IFABP水平显著降低(P<0.05),IL-13 水平显著升高(P<0.05)。4.术后24h小肠组织HE染色切片显示:与Sham组比较,CLP组小肠组织绒毛明显断裂、与固有层分离,黏膜下明显水肿,血管明显扩张充血,并伴有大量的炎性细胞浸润,病理损伤评分明显升高(P<0.05);与CLP组相比,EXO组和EXD组病理损伤程度减轻,病理损伤评分下降(P<0.05)。5.术后24h小肠组织qPCR结果显示:与Sham组进行比较,CLP组HMGB1以及NF-κB mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与CLP组进行比较,EXO组和EXD组HMGB1、NF-κB mRNA表达的水平显著降低(P<0.05),与EXD组相比,EXO组HMGBI以及NF-κB mRNA表达的水平无明显差异(P>0.05)。6.术后24h小肠组织Western blot结果显示:与Sham组比,CLP组HMGB1、NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与CLP组相比,EXO组HMGB1、NF-κB蛋白表达水平,EXD组HMGB1蛋白表达水平显著下降(P<0.05);与EXD组相比,EXO组HMGB1、NF-κB蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。[结论]1.人脐带间充质干细胞外泌体可以减轻盲肠结扎穿孔术诱导的脓毒症小鼠炎症反应,抑制小肠组织晚期炎症介质HMGB1及下游信号通路分子NF-κB的表达,减轻了脓毒症小鼠肠黏膜屏障损伤。2.去外泌体上清液对脓毒症小鼠也具有炎症调节及肠黏膜屏障保护作用。